转基因烟草的研究进展

2015-04-15陈永涛金吉林张兴无李兴忠

甘肃农业科技 2015年10期

陈永涛，金吉林，张兴无，李兴忠，罗会

（贵州省果树科学研究所，贵州贵阳 550006）

烟草在整个生育过程中遭受多种病害及虫害的危害，使其产量与品质受到严重影响，造成了巨大的经济损失［1］。目前防治烟草病虫害的方法主要是种植抗病虫品种和药剂防治蚜虫。由于农药在烟草上会有残留以及会对环境产生污染，所以选育和种植抗性品种在综合防治烟草病虫害方面就成为最经济有效的方法［2］。随着植物基因工程技术的发展，将来源于动植物和微生物等的抗病虫基因导入植物以获得抗病虫植株，进行作物抗病虫品种的培育逐渐成为植物病虫害防治的发展趋势之一［3-4］。应用转基因技术将介导病毒抗性的基因导入烟草，获得抗病毒病及抗虫的转基因烟草，能够有效抵御烟草病虫害危害。我们对近30 a来基因工程技术在烟草中的应用进行综述。

1 抗病毒病转基因烟草

近年来，利用基因工程防治烟草病毒病的主要策略，包括导入衣壳蛋白基因、利用病毒的复制酶基因、利用反义RNA、卫星RNA、植物编码的抗病毒基因及移动蛋白等［5］。

1990年，Golemboski等将TMV U1株系的一段核酸序列转入烟草，结果转基因植株在用TMV U1株系病毒粒子或病毒RNA接种时都表现出高度抗性［6］。1994年，Carr和Gal-on认为转基因植物表达的复制酶蛋白在病毒的侵染过程中作为一种调节蛋白发挥其正常功能，从而打破了病毒正链和负链复制的平衡，或是干扰了控制复制酶活性的反馈抑制途径［7］。1994年，刘玉乐等将普通烟草G140和表达黄瓜花叶病毒（CMV）的卫星RNA的转基因烟草Sat-G140进行抗烟草花叶病毒（TMV）的侵染试验，结果表明转基因烟草Sat-G140表现的感染TMV的症状较轻，说明卫星RNA可减弱 TMV引起的症状［8］。1995年，Lomonossoft等认为，在RNA水平上，是转录出的mRNA与病毒的复制酶进行了无效结合从而抑制病毒复制酶的正常功能，或是mRNA诱导了植物的自然抗病性等［9］。1999年，张振臣等发现，将黄瓜花叶病毒FNY-CMV株系的RNA3 CDNA克隆，构建运动蛋白（MP）基因，再用土壤农杆菌根癌农杆菌（LBA 4404）介导将该基因转入烟草NC89，经抗性鉴定发现转基因烟草对CMV有一定的抗性［10］。2001年，黄晓躁等将番茄花叶病毒移动蛋白基因转入烟草中，并用卡那霉素筛选获得了一系列的抗性苗，活性测试证明25%的抗性苗有较好的抗番茄花叶病毒的特性［11］。2002年，唐嘉义等报道，将番茄斑萎病毒（TSWV）的外壳蛋白基因转入烟草后，就获得了抗TSWV的转基因烟草，同时发现该转基因烟草对TMV也有一定的抗性［12］。2003年，郭兴启等报道，通过LBA 4404介导的方法将非翻译的马铃薯YN病毒（PVYN）PVYNCP基因转入烟草NC89后，获得了高度抗PVYN的转基因植株。并初步证明，对PVYN的侵染也具有高度抗病性［13］。2005年，张凯等将TMV的部分运动蛋白基因（驻MP）构建成反向重复结构，插入植物表达载体pBin438上，通过三亲交配法导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EH105后，应用农杆菌介导法转化烟草品种云烟87，获得了50株转基因烟草。用TMV对转基因烟草进行挑战接种，症状观察和病毒浓度的TAS-ELISA检测表明，转基因烟草对TMV的抗性包括3种类型：免疫型占10%，抗病型占4%，感病型占86%［14］。2007年，孟凡宏等将水稻黄单胞细菌白叶枯致病变种（Xanthomonas oryzae v.oryzae）编码的HarpinX100的hrfA基因及其N-末端缺失突变基因AB分别连接到双元载体pBI121上，构建成转基因载体i，并经冻融法转化土壤杆菌EHA105，采用叶盘法转化烟草，用卡那霉素抗性筛选再生植株。通过PCR扩增检测了转化烟草中的靶基因序列即35S启动子序列，对T1代PCR阳性植株进行了PCR-Southern杂交和RT-PCR分析。结果显示，外源基因已整合到转基因烟草基因组中，并在转录水平正常表达。用从转hrfA基因和AB片段的烟草中提取可溶性蛋白注射烟草都能引起过敏反应，说明目的基因在转基因烟草中能表达出有活性的蛋白。抗病性鉴定结果表明，转N-末端AB片段的烟草和转hrfA全长基因的烟草一样表现出对TMV的抗性［15］。2008年，李黎等将来自粟酒裂殖酵母的pac1基因导入原核表达载体pET-5a中，并转入大肠杆菌 BL21（DE3）pLysS，经IPTG诱导，其表达产物能够降解4种植物病毒CMV、TMV、Rice black-streaked dwarf（RBSDV）、Rice dwarf virus（RDV）和3种类病毒Apple scar skin viroid（ASSVd）、Coleus blumei vi原roid（CBVd）和 Hopstunt viroid（HSVd）的 dsRNA。将pac1导入双元载体pBI121，并转入根癌农杆菌LBA4404，以烟草（品种NC89）组培苗的叶片为受体材料进行转化，经过诱导愈伤、分化、再生和筛选培养，获得了50株Kana抗性植株，收获T1种子分别播种，对这些转基因植株进行PCR、PCR-Southern和RT-PCR检测，结果表明pac1基因已整合到受体基因组中［16］。同年，朱常香等分别以马铃薯Y病毒（PVY）、TMV和CMV全长衣壳蛋白（CP）基因为模板，通过设计PCR引物和亚克隆获得PVY CP 3'端长度100 bp、TMV CP 3'端长度100 bp和CMV CP 3'端长度200 bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因，并以此为模板构建反向重复结构嵌合基因的植物表达载体pRHPTC。将pRHPTC通过冻融法导入农杆菌LBA4404，采用叶盘法转化烟草NC89。通过该方法可获得抗多种植物病毒的转基因烟草［17］。2010年，宋莉等通过农杆菌介导法将35S驱动的干扰素基因ChIFN-琢转化烟草，Southern杂交和Western杂交进行目的基因的转化、表达检测，重组蛋白的数量通过ELISA测定，对获得的转基因烟草植株进行TMV接种试验，结果表明ChIFN-琢基因的转化赋予了转基因烟草对TMV的抗性，进一步的荧光定量PCR差异表达检测结果表明，该抗性可能与转基因烟草体内防卫基因PR-la、抗病N基因和信号转导MAPK基因受到上调表达有关［18］。2013年，江彤等为了获得抗PVY转基因烟草，分别扩增PVY HC-Pro基因3'端正、反向片段，构建反向重复植物表达载体，利用农杆菌介导法转化普通烟草品种云烟85，经抗性筛选及抗病性鉴定，获得T0代转基因抗病烟草株系。繁殖T0代抗病株系，抗病性鉴定发现，部分抗病株系的T1代烟株发生了一定比例的抗感分离。Real-time PCR检测发生抗感分离的T1代烟株发现，抗病烟株中PVY HCPro基因RNA积累水平显著低于感病烟株，说明抗病烟株中HC-Pro基因发生了RNA沉默。利用dsRNA技术沉默HC-Pro基因，获得了烟草品种云烟85的T1代转基因抗PVY株系［19］。同年，孙书娥等应用RNA沉默防治病毒病原理构建中国番茄黄化曲叶病毒（TYLCCNV）外壳蛋白部分基因片段dsRNA（double-strand RNA）导入本氏烟（Nicotiana benthamiana）获得了抗TYLCCNV的转基因烟草，结果表明，目的基因已整合到转基因烟草植株的基因组中［20］。

2 抗虫转基因烟草

2.1 利用苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因

提高烟草抗虫性的第一种策略是利用苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因，Bt-toxin基因是目前世界上应用最为广泛的抗虫基因，其表达产物可与昆虫中肠道刷状缘表皮细胞表面的特异受体结合，干扰钾ATP酶活性，造成离子渗漏，破坏细胞的渗透平衡，进而引起细胞肿胀和裂解，并最终导致昆虫死亡。

1987年，Vaeck等获得了世界上首例转Bt基因的工程植株。方法是使用全长的和3'缺失的Cryla（b）基因，在甘露碱合成酶基因启动子的下游转化烟草，试验证明在3'端有缺失的Cryla（b）杀虫基因的转基因烟草具有一定的抗虫性［21］。1991年，田颖川等利用定点突变改造苏云金杆菌（Bacil原lus thuringiensis）HD-1的δ-内毒素基因 5'端，酶切对3'端进行缺失后，在大肠杆菌中仍能表达出有杀虫活性的被修饰的毒蛋白。将上述加工过的基因插入到双元载体pBin437（pBin19的派生质粒）中，借助辅助Ti质粒pAL4404转入烟草，获得了抗卡那霉素的再生植株。经Southern印迹和狭槽印迹（Slot blot）杂交证明有1～5个拷贝的毒素基因整合至烟草染色体中。Nolthern印迹法分析结果表明，这2类基因都在转基因植株中得到表达，有4株5.3 kb类型，3株6.6 kb类型的转基因植株对烟青虫有高抗性，与对照相比，这7株转基因烟草植株的杀虫率可达40%～50%，并能显著抑制昆虫蜕皮和生长发育，表现明显的抗虫作用。结果表明，这2类毒蛋白基因都可在植物中表达并赋于转基因植株以抗虫性［22］。

2003年，谢龙旭等构建了含草甘膦抗性突变基因（aroAM12）和人工合成重组Bt抗虫基因（Bts1m）的植物表达载体 pcM12-slm。Northern blot、Immunodot blot分析进一步证明整合的2个基因在转录、翻译水平上均进行了表达，不同植株之间表达存在着差异。草甘膦抗性和虫试试验证明，获得的转基因烟草对草甘膦和烟青虫具有很强的抗性［23］。2012年，高川等从苏云金芽胞杆菌中克隆到的2个杀虫基因Cry2Ab4和vip3Aall，分别构建了pCS2Ab和pCScip3A植物表达载体，利用农杆菌介导法转化烟草品种NC89，并得到32株和35株阳性转基因植株。通过对其进行RTPCR分析、Western杂交分子检测证实2种外源基因在烟草植株中可正常表达。人工饲喂初龄小地老虎幼虫，对2种转基因植株进行生物活性检测，结果显示饲喂转基因叶片的小地老虎幼虫死亡率在82%以上，抗虫能力比对照显著提高［24］。

2.2 利用蛋白酶抑制基因组

另一种抗虫转基因烟草的获得的方法是利用蛋白酶抑制基因组。蛋白酶抑制剂（Proteinasein-hibitor，PI）是一类存在于某些植物中的蛋白质，可与昆虫消化道内的蛋白消化酶相互作用，形成酶-抑制剂复合物（EI），由此抑制蛋白消化酶的活性。此外，蛋白酶抑制剂还可进入昆虫淋巴系统，干扰昆虫免疫功能和蜕皮过程。

1987年，Hilder用土壤农杆菌的Ti质粒介导，将花椰菜叶病毒CaMv 35S启动子与豇豆胰蛋白酶抑制基因组装后转化烟草，转基因烟草植株具有较强的抗虫特性［25］。2010年，宋洪元等将置于2个同向lox位点之间的Bar基因表达盒与大豆胰蛋白酶抑制剂SKTI基因表达盒融合后获得相应植物表达载体，转化烟草Wisconsin 38后获得对棉铃虫具有明显抗性的SKTI转基因植株。此外，作物育种专家还利用其他抗虫基因及转双价抗虫基因，获得了具有较好抗虫性的烟草［26］。2012年，齐洪华等根据已克隆的CABYV P0蛋白基因序列，设计带酶切位点的特异性引物，PCR扩增用于构建RNAi表达载体的P0蛋白基因正反义片段。将正反义片段分别插入含有内含子的中间载体pBSint上，得到重组的中间载体pBSint-P0-F-R。用Sal I和Sac I双酶切pBSint-P0-F-R，将切下的包括内含子和正反义P0蛋白基因在内的片段定向克隆到植物表达载体pCambial 300上，得到含有发卡结构的RNAi表达载体pCambia-P0-F-R。通过农杆菌介导的方法将该表达载体转化本生烟，经PCR检测，得到4株阳性转基因植株［27］。

3 展望

虽然烟草抗病虫转基因技术的发展已有20多年的历史，但转基因技术仍有许多不足。目前，人们对转基因植物的安全性存在疑虑，并且转基因技术本身还存在一些缺陷，主要表现在转基因沉默，基因漂移，转基因抗病植株抗性的丧失以及抗病性转基因的生态威胁方面，但任何事物都有两面性，随着生物技术的发展，转基因技术将会在植物抗病育种中得到很好的应用。

通过20多年的研究，烟草抗病虫转基因技术取得了较大的进展，特别是近年来发展了一些新的介导抗病性方法。但仍存在许多缺陷，如基因沉默现象使转入抗病基因的植株抗病性不能正常表达；PTGS效应对整个生物体的影响不明确，对不同的作用靶位，其效应存在差异，通过PTGS途径获得的抗病性在植物内是否可以遗传目前仍不清楚。另外，一些介导病毒抗性的方法对导入基因的作用机制及其与植物体互作方面的研究没有确定的理论，并且在实际应用中未取得太大的进展。以后的研究工作中，应对各种介导病毒抗病性的机制和作用机理以及互做体系进行更准确、深入的研究，以便从根本上解决问题，进而促进抗病毒转基因烟草更快、更有效的发展。

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