甲胎蛋白定量方法研究进展

孙雪晴，宋德伟，徐 蓓，武利庆，胡高飞，李红梅

(1.北京化工大学，北京100029;2.中国计量科学研究院，北京100013)

甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)是原发性肝癌的标志物[1]，为了准确检测血清中AFP的含量，提高检测结果的可比性，亟需建立AFP准确测定的量值溯源体系，这对于肝癌患者的早期诊断和病情监测非常重要。本文将对AFP的定量方法进行综述。

AFP是人胚胎期血清中的主要蛋白成分[2-3]，是一种糖蛋白，相对分子质量约70 000[4]。在正常的情况下，这种蛋白主要来自于胚胎的肝细胞[5]。在胎儿出生大约2周后，AFP会从血液中消失，所以正常人的血清中 AFP的含量不足20 μg/L。当肝细胞发生癌变时，会恢复产生这种蛋白的功能，并且其在血清中的含量会随着病情的恶化而急剧增加[6]，因此AFP就成为诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标[7]。另外，AFP在睾丸非精原生殖细胞肿瘤[5]及卵巢生殖细胞肿瘤[8]等患者血清中亦可出现不同程度的升高，因此AFP作为一种重要的肿瘤标志物应用于临床检测。

一、AFP含量的量值溯源体系

AFP检验结果的准确性直接影响着肝癌等疾病的诊断、治疗及预防，因此得到准确且具有跨时空可比性的临床检验结果是防病、治病和提高人类健康水平的基本需要。而实现检验结果准确的最有效方法是建立和保证检验结果的溯源性[9]。因此实现蛋白质含量测定结果溯源到国际基本单位是蛋白质计量追求的最终目标之一[10]。标准物质是量值的载体，是实现溯源体系的关键要素，是保证测量结果在时间和空间上准确和可比的重要基础，也是实现有效测量即准确、可比、可溯源测量的根本保证。

1975年世界卫生组织与各个国家的研究机构合作，研制出脐带血清冻干的AFP标准物质(72/225)，经8个国家的11个实验室检验比对及国际专家讨论后，将其确定为国际通用标准物质用于世界各国研制分析标准物质溯源。临床检验中的分析方法众多，不同原理的检验方法或不同试剂的使用都可能引起测定结果的不同，因此也需要国际通用的方法来配合使用。标准方法的研制对临床检验AFP具有重要的意义。

目前，我国尚未研制出AFP标准物质。随着现代分析技术的飞速进步，越来越多的临床分析检验仪器引入我国，不同厂家也研制出了许多AFP临床检验试剂盒，由于缺乏高等级标准物质，检验结果无法溯源到国家标准，往往出现同一样本不同医院检验结果不一致，甚至导致疾病诊断结果相反的情况。因此，为了保证AFP分析检测结果的准确和可比，我国亟需研制出AFP标准物质及其相关的检测参考方法，使AFP的标准化得以实现。

二、AFP的定量检测方法

自1956年在人体血清中发现AFP的存在以来，AFP的检测已发展了多种方法[11-22]，几乎现有的免疫学检测方法均可用于AFP的测定。目前国内的临床检测主要是利用蛋白定量试剂盒及免疫测定分析仪通过免疫的方法体外测定人血清或血浆中AFP的含量。稳定同位素标记技术的发展为准确定量AFP提供了可能。同位素稀释质谱法由于具有可绝对测量、敏感性高、测量动态范围宽且测量值能直接溯源到国际基本单位等优点，近年来被国内外实验室广泛用作蛋白准确定量的方法，也是目前公认的蛋白标准物质定值的基准方法。以下分别就免疫分析法及质谱法在定量AFP研究中的应用进行概述。

(一)免疫分析法

自从1959年YALOW等[23]将放射性同位素与免疫反应结合建立了放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)后，发展了一系列免疫分析法，如酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[24-26]、荧光免疫分析法(fluorescence immunoassay，FIA)[27-28]和化学发光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay，CLIA)[29]等。

1.RIA RIA是利用同位素标记的和未标记的抗原与抗体发生竞争性抑制反应的方法。1960年YALOW等[30]第1次用RIA检测了血浆胰岛素的含量。随后RIA受到了许多科研人员和医学工作者的关注，得到了广泛应用。

通过RIA检测血清中AFP含量成功诊断出了许多早期肝癌。FORRESTER等[11]把用溴化氢活化后的凝胶结合上AFP抗体作为免疫吸附剂，将从脐带血清中提取出的AFP碘化后，进行了双抗体放射免疫测定，得到的标准抑制曲线线性范围为 50 ～1 000 ng/mL。KEMP 等[12]用125I标记的抗体和纤维素耦合的抗体对母体血清中的AFP进行了双位点RIA检测，该方法与传统的RIA相比，大大缩短了检测的时间。

RIA以其敏感性高、特异性好和实用性强等特点吸引着全国的生物医学工作者，但由于操作中始终存在放射性污染、同位素半衰期短及试剂盒性能不稳定等问题，人们发展了一系列非放射性标记技术，如酶标记、化学发光等。

2.FIA FIA是历史最悠久的一种标记免疫分析法，敏感性很高，在传染病诊断上有着极为广泛的用途。ZHU等[13]用血红素代替辣根过氧化酶作为对羟基苯和过氧化氢荧光反应的标记物。血红素标记的和未标记的AFP与AFP单克隆抗体结合后，通过荧光分析进行检测，得到其检测的线性范围是0～380 ng/mL，检出限为1.0 ng/mL。YANG等[14]用四磺酸基酞菁铁作为荧光反应的标记物对血清中的AFP进行检测，得到了类似的结果。AO等[15]基于涂了单克隆抗体的纳米球颗粒在异硫氰酸盐作用下产生荧光淬灭的原理，发展了一种利用金纳米磁性小球快速准确检测抗原的方法，该方法检测AFP的检出限为0.17 nmol/L。

3.免疫酶法(enzyme immunoassay，EIA)EIA是借助酶细胞化学等手段显示组织抗原或抗体的新技术，这种方法在医疗实验室、监管机构等领域是一种家喻户晓的方法，它是在FIA的基础上发展起来的。由于FIA具有荧光标本不能长期保存以及需要价格昂贵的荧光显微镜才能观察的不足，1966年NAKANE等[31]尝试了用酶代替荧光素来标记抗体的方法，从而成功地开创了酶标记抗体的新技术，经过70和80年代的发展，EIA有了很大的进步，成为了当今使用最为广泛的免疫组织化学技术。AIZAWA等[32]利用过氧化酶标记的AFP和非标记的AFP与抗体的竞争性结合发明了一种传感器，其AFP检测的线性范围为10-11～10-8g/mL。

与FIA相比，EIA敏感性较高，标本能够长期保存，并且能够假设HE染色等其他付染，有利于将被检测物质与病变的形态学改变联系起来，弥补了FIA的不足。但同时EIA也有其不足之处，因此又在其基础上发展了ELISA和CLIA等。

4.ELISA ELISA中最常用的是双抗体夹心法，其是利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与标本中被检测抗原分子上的2个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标记抗体免疫复合物，通过测定生成的有色底物的质量来确定待测抗原的含量。XU等[16]发展了一种夹心式的流动注射异构酶免疫分析法，用电流检测在酶促反应的过程中生成的对氨基苯酚的含量，从而检测血清中AFP的含量，测定结果的变异系数＜8.2%，检出限达到了0.163 μg/L。焦奎等[17]提出了邻氨基酚-过氧化氢-辣根过氧化物酶伏安酶联免疫分析测定人体血清AFP的新方法，克服了传统ELISA光度法测定干扰因素多的缺点，以生物酶作为标记物，利用电化学检测得到的AFP测定线性范围为1.25 ～400 mg/L。陈曲波等[18]分别采用微阵列ELISA和电化学发光免疫分析法对AFP、癌胚抗原及前列腺特异性抗原等6种临床常见肿瘤标志物进行检测，结果显示2种方法检测AFP的阳性率差异无统计学意义(P＞0.05)，检测结果具有较好的一致性。

5.CLIA CLIA是分子发光光谱分析法中的一类，是指物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，当受激分子由激发态回到基态时，便会发出一定波长的光。根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或发光总量来确定组分含量的分析方法即为 CLIA。THORPE 等[19]用 3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧环乙烷二钠盐[3-(2-spiroadamatane)-4-methoxy-4-(3-phosphoryloxy)-phenyl-1，2-dioxetane，AMPPD]作为CLIA的基质来检测人体血清中AFP的含量，AMPPD与酶发生反应时会在477 nm处发光。这种方法的AFP定量检出限为33～470 ng/L。此方法与用碱性磷酸酶的酶免疫比色分析法相比，敏感性提高了67倍，检出限达到 0.03 μg/mL。ARAKAWA 等[20]将一个抗体标记上 β-d-半乳糖苷酶，另一个抗体涂在聚苯乙烯管上，用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷做CLIA的基质来测定人体血清中的AFP含量，检出限达到0.5 ng/mL，与RIA检测的线性相关系数达到0.99。荣扬等[21]分别利用光激化学发光法和酶促化学发光法测定了血清中AFP和癌胚抗原的含量，得到光激化学发光法检测AFP的敏感性为0.112 ng/mL，线性范围为2.6～950.2 ng/mL，与酶促化学发光法检测结果高度相关，可满足临床检验的要求。

6.免疫传感器(immunosensor) 免疫传感器是由偶联抗原/抗体分子的生物敏感膜与信号转换器组成的，其是基于抗原和抗体特异性免疫反应的一种生物传感器[33]。作为一种新兴的生物传感器，具有高度的特异性和极低的检出限，能够很好地适应很多领域的分析要求。免疫传感器可分为无标记型和标记型2种类型，其中无标记型按其测定原理主要分为光学免疫传感器、电化学免疫传感器以及压电免疫传感器。近年来，发展了许多用免疫传感器检测AFP含量的方法。

光学免疫传感器结合了免疫分析与光学生物传感器的优点，具有良好的特异性和较低的检出限。YANG等[34]发展了一种简便的荧光生物传感器定量AFP，该传感器的原理是基于免疫色谱测试条(immunochromatography test strip，ICTS)上的夹心免疫反应，结合量子点发强光和高的耐光性以及ICTS的优点，该方法在10 min内50μL AFP标准品的检出限可达到1 ng/mL，对1 000份临床血清AFP进行检测，结果与AFP电化学发光免疫试剂盒检测结果相比有良好的一致性。

压电免疫传感器是近20年发展起来的新型生物传感器，它能够动态检测抗原抗体反应，非常利于免疫反应的动力学分析。TYAN等[35]将AFP单克隆抗体通过水溶性的N-乙基-N-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和羟基琥珀酼亚胺作为连接试剂，连接在自组装单层膜上，从而把AFP单克隆抗体固定在金表面，制成压电生物传感器来检测AFP的含量。该方法的检出限和线性范围分别为15和15～850 ng/mL。与RIA测定的结果进行比较，该方法检测AFP标准品和血清AFP的线性相关系数分别为0.990 3和0.975 0，且具有检测方法简便、耗时较短、无需多重标记的优点。

电化学免疫传感器是结合了电化学发光测量与免疫传感器的应用，由于其结合了电化学发光的高敏感性和免疫分析的高选择性优点，已经吸引许多科研人员的关注[36]。纳米材料独特的理化特性使之在高性能的电化学和电化学发光传感器的发展中有很广阔的应用前景[37]。电化学免疫分析与纳米材料的结合可以放大电化学信号，为更敏感地检测肿瘤标志物提供了全新的方法[38]。SU 等[39]用硫堇/纳米金叠层自组装膜和单层碳纳米管做免疫探针，用双功能金纳米颗粒增强信号制成电化学免疫传感器来检测人体血清中AFP的含量，并与其他常用临床免疫学检测方法的结果进行对比，无明显差异。该方法检测AFP的动态线性范围是0.25～45 ng/mL，检出限是0.05 ng/mL。WANG 等[40]用脂质体包裹Ru(bpy)32+作为标记，将电极涂上金纳米颗粒，金纳米颗粒可以提供大的活性表面，而脂质体可以封闭大量的报道分子，从而能够增强电化学信号。这样的免疫传感器检测血清中AFP含量的线性范围为 0.005～0.2 pg/mL，检出限可达到0.001 pg/mL。GUO 等[41]首次将石墨烯-硫化镉量子点-琼脂糖复合物用3-氨基丙基三乙氧基硅烷与玻璃碳电极结合，可增强电化学发光的信号，从而发展出一个快速、超敏感的AFP检测方法，该方法的检出限和定量限分别是0.000 2和0.000 5 pg/mL。

免疫分析法虽然是一种廉价且有效的分析检测方法，但由于其具有耗时长，不同的供应商会对检测结果产生影响，检测结果不具有跨时空的可比性等缺点，必须发展一种能直接追溯到国际基本单位、有坚实的理论基础和严格的数学表达的权威方法来保证检测结果的准确和溯源。

(二)质谱法

基于质谱技术的蛋白质定量方法已经逐渐成为生物医学和临床研究的重要组成部分[42]，在肿瘤标志物的检测分析中也得到了广泛的应用[43]。质谱技术可以和免疫分析结合检测血清中肿瘤标志物的含量。ZHANG等[22]用Eu3+和 Sm3+分别标记AFP和人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)抗体后，通过电感耦合等离子体质谱仪同时检测了AFP和人绒毛膜促性腺激素的含量，得到测量线性范围分别是2.6 ～500 和 5.0 ～170 μg/L，检出限分别为 1.2和1.7 μg/L。NICOL 等[44]用类似的方法对肺癌标志物——癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)进行了定量检测。

同位素稀释质谱法是将已知质量和丰度的稳定同位素作为稀释剂加入标本中，混合均匀后用质谱测定混合前后同位素丰度的变化，由此计算出标本中该元素含量的方法。目前国际公认的化学测量权威方法有精密库仑法、同位素稀释质谱法、重量法、容量法和凝固点下降法等。其中，同位素稀释质谱法是唯一一种微量、痕量和超痕量元素权威测量方法。蛋白裂解同位素稀释质谱法可以用来准确定量蛋白质。早在20年前，科研工作者已经第1次尝试用氘标记的合成肽段作为内标物检测目标蛋白质[45]。BARNIDGE 等[46]合成了用2个13C和1个15N标记甘氨酸的前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)的1个肽段(IVGGWECEK)，用其作为内标肽段检测了5种不同浓度的血清PSA含量，所得R2值为0.971。BONDAR等[47]用合成的标记肽段作为内标检测了血清 Zn-α-2-糖蛋白的含量，所得检出限为0.08 mg/L。WILLIAMS 等[48]利用同位素稀释质谱法测定了患有子宫癌的患者血清中C反应蛋白(C reactive protein，CRP)含量，得到的结果与ELISA测定结果的R2值为0.970 8，且发现利用蛋白裂解同位素稀释质谱法能检测到的CRP浓度是ELISA可检测的10倍。KUHN等[49]用13C标记的CRP特征肽段对患有风湿性关节炎的患者血清中的CRP含量进行测定，并与健康人体检测结果进行了对比。

虽然应用同位素稀释质谱法进行蛋白质准确定量分析的研究已经发展了很多年，但由于糖蛋白的结构复杂，将其应用于糖蛋白测定的相关报道还较少。目前还未有同位素稀释质谱法应用于AFP定量研究的报道。

三、展望

随着生命科学的进步和生物产业的发展，生物技术被越来越多地应用于各个领域，其中蛋白质作为一类重要的生物大分子，其分析技术得到了长足的发展和应用，尤其是临床检验中肿瘤标志物的测定受到了广大科研工作者的重视。目前，我国还没有AFP相应的标准物质和参考方法，检验结果无法实现溯源，这对临床诊断和筛查结果会产生较大的影响。因此，建立AFP含量量值溯源传递体系是亟待解决的问题。同位素稀释质谱法因其具有敏感性高、准确度高且测量结果可溯源至国际基本单位等优点，是AFP标准物质研制的潜在方法。AFP是一种糖蛋白，在准确定量技术上还有很大的研究和探讨空间。中国计量院科技支撑计划目前已经开展AFP等肿瘤标志物标准物质的研究，以期为肿瘤标志物标准化奠定基础。

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