代谢组学在辐射损伤研究中的应用



代谢组学在辐射损伤研究中的应用

郭明星，吴诚，童卫杭

[作者单位] 100088 北京，第二炮兵总医院药学部

[关键词]辐射损伤; 代谢组学; 机制研究; 生物标志物

随着核能及放射技术在各领域的广泛应用，人们的工作和日常生活不可避免的会接触辐射，辐射造成的损伤也日益受到关注。辐射流行病学调查发现，长期低剂量辐射会出现头晕、乏力、记忆力减退等症状[1-5]，大剂量辐射会造成造血、胃肠、神经血管和皮肤等一个或多个系统损伤，引起神经、内分泌等系统调节障碍，破坏机体组织的蛋白质、核酸和酶等引起机体物质代谢紊乱[6-7]。辐射损伤是多层次、多步骤、多阶段的复杂过程[8]，目前迫切需要对其损伤机制和早期诊断进行研究。

代谢组学是指通过考察生物体系(细胞、组织或生物体)受刺激或扰动后(如将某个特定的基因变异或环境变化后)，其代谢产物(内源性代谢物质)种类、数量及其变化规律的学科[9]。目前辐射损伤在基因水平和细胞水平已经进行了广泛的研究，但由于其损伤的复杂性和终端表象的差异性，对辐射损伤的研究仍没有突破性进展。基于辐射损伤最终都会导致终端代谢物的一系列变化，通过代谢组学技术在整体代谢水平上研究辐射损伤的发生、发展机制，有助于我们发现可用于辐射损伤早期诊断、疗效评估和预后的标志物。本文就近年代谢组学在辐射损伤中的研究做一综述。

1代谢组学研究方法

代谢组学研究流程主要包括样品采集与前处理、数据的采集和数据分析3个步骤。1.1代谢组学样品采集与前处理代谢组学的研究对象广泛，目前对体液(血液、尿液、脑脊液等)，组织，细胞培养液等的样品采集和前处理均发表了相关操作规程[10-14]。其中应用于辐射损伤的研究样本多为尿液和血液(血清和血浆)。研究学者通常根据检测代谢物个数的不同将代谢组学分为靶标代谢组学和非靶标代谢组学[15]。靶标代谢组学是指一定数量的代谢物的定性、定量分析;非靶标代谢组学是指无偏见的测量和比较尽可能多的代谢物。目前对于辐射代谢组学的研究大部分局限于非靶标代谢组学机制探索阶段，进一步的靶标代谢组学生物标志物验证研究仍存在不足。

1.2代谢组学数据采集技术目前，代谢组学研究主要的数据采集技术为基于核磁共振光谱(NMR)和质谱(MS)的检测技术。其中应用最广的为NMR、液相色谱质谱连用(LC-MS)和气相色谱和质谱连用(GC-MS)技术，各类检测技术均有其优缺点。代谢组学是基于NMR技术发展起来的一门学科，NMR对生物样品的选择宽泛，不需要复杂的样品前处理，对样品无破坏性，检测无偏向性，但对酸碱度、离子浓度、温度都很敏感，分析灵敏度低、谱图重叠相互干扰，导致图谱解析困难。GC-MS是分析挥发性化合物的一种高效技术，适用于GC-MS分析的化合物必须是可挥发的或是经过衍生化可挥发的化合物。GC-MS分析速度快，灵敏度高的特点有利于微量物质的分析，较高的柱效加上合适的梯度升温可以将绝大多数的峰形加以分离以用于定量;以较完整的谱库为基础的结构分析软件为未知物质的定性提供了极大的便利。GC-MS技术最大的缺陷是往往需要对样品进行预处理，对生物样品中的原始信息造成了干扰，不利于代谢组学的“全谱”分析。LC-MS相对于GC-MS可以分析较高极性和较大分子量的化合物，并且样品无需衍生化处理。随着超高效液相色谱(UPLC)和高分辨质谱(Q-TOF/MS和LTQ/Orbitrap等)的出现，为复杂生物样品提供了更好的分离能力和结构鉴定能力。目前，有些研究常采用多种技术进行联合检测，进行分析方法的整合，来提高检测数据的全面性。

1.3代谢组学数据分析技术代谢组学的数据分析一般包括:数据预处理、模式识别、代谢物鉴定和生物标志物验证。数据预处理主要包括滤噪、峰识别、重叠峰解析、峰对齐、峰补齐和归一化等。经过数据预处理后，得到的二维数据矩阵用于模式识别。模式识别包括无监督学习方法和有监督学习方法。无监督学习方法是将所得分类信息和样品的原始信息比较，找出差别，其不需要任何有关样本类别的知识，直接从己有数据中获得样本的类别归属。主要包括:主成分分析，层次聚类分析，自组织图、聚类分析。有监督学习方法是利用多参数模型对样品进行识别和分类，其需要事先获得样本的分类信息，利用已知类别的样本作为训练数据建立和优化有关分类模型，以对后续新样本的类别进行预测。主要包括:判别分析、偏最小二乘法、偏最小二乘- 判别分析、人工神经网络等。

2代谢组学在辐射损伤研究中的应用

辐射是由不同能量的电磁波尤其是χ、γ射线等高能电磁波，α、β粒子、超热中子等放射性粒子以及铀、氡、钚等放射性同位素引起的一种能量传递方式[16]。通常根据辐射频率及作用形式分为电离辐射和非电离辐射。电离辐射是指能引起被作用物质电离的辐射。对于生物组织来说，电离辐射的危害性很大，由于造成危害的主要是量子能量，而不是总能量，因此，即使在低功率照射下，也会产生累积效应，造成生物组织的破坏与损伤。非电离辐射一般不引起物质分子的电离，只导致分子的振动、转动或电子能激状态的改变，因此非电离辐射的量子能量不足以破坏分子，它对生物体的破坏与损伤，取决于其总能量，即必须在高功率和一定的照射时间下才能发生。非电离辐射会使生物体在没有明显升温的条件下，导致神经系统和心血管系统等功能紊乱。目前代谢组学在辐射损伤的研究大都集中于电离辐射损伤，对非电离辐射损伤研究较少。

2.1代谢组学在电离辐射研究中的应用γ射线辐射生物体后，生物机体产生自由基，当自由基产生过多而不能及时清除时就会引起一系列的辐射损伤[17-20]。四氢生物蝶呤(BH4)是一氧化氮合酶(NOS)的重要辅助因子。其缺乏将导致NOS解耦联，生成自由基O2-，O2-能与NO反应，生成ONOO-，ONOO-是一种很活泼的阴离子，可以破坏酶的结构和功能，引起细胞损伤。有研究者采用代谢组学技术研究了非致死剂量的电离辐射在过表达GTPH-1 反馈调节蛋白的转基因小鼠肝组织中的代谢情况[21-22]，发现BH4的相对含量在辐射组明显较低，并发现了一系列与氧化应激和脂质过氧化有关的代谢物。Ahmad等[23]采用1HNMR对γ射线辐射的小鼠尿液和血清进行代谢组学分析，在5Gy照射后的小鼠尿液中，柠檬酸盐、α-酮戊二酸、丁二酸、马尿酸、三甲胺与非照射组相比具有明显差异，通过相关的代谢路径分析发现γ射线辐射扰乱了肠道微生物菌群的生长和机体能量代谢，血清研究还发现γ射线辐射损伤与脂质代谢、能量代谢紊乱有关。

机体受到辐射作用后，血细胞的增殖、分裂功能下降，血细胞来源减少，白细胞下降，骨髓造血功能障碍[24]。基于此，采用γ射线全身大剂量照射可建立血虚证模型。霍超等[25]采用60Coγ射线3．5Gy照射剂量全身1次性照射小鼠建立小鼠血虚证模型，并以四物汤连续7d灌胃给药进行干预。采用NMR技术检测血清、胸腺、脾脏以及股骨上段骨髓组织提取液观察其代谢谱的变化。经研究发现，葡萄糖、肌酐、磷酸化胆碱、胆碱、肌酸、乳酸、低密度脂蛋白等在正常组与辐射损伤所致血虚证组代谢波动较大，给予四物汤干预后相关化合物具有转归趋势。辐射损伤所致血虚证的机制可能与机体无氧氧化功能受损、能量代谢和脂类代谢失调、细胞内外渗透压平衡受到破坏以及机体免疫功能失调有关。IdleJR课题组对γ射线辐射生物标志物进行了一系列系统研究。该课题组首先采用两个强度的γ射线(3Gy和8Gy)照射小鼠，收集小鼠照射前和照射后24h的尿液进行UPLC-Q-TOF/MS代谢组学分析。研究发现尿液中胸苷的相对含量在γ射线照射组明显高于非照射组[26]。随后，该课题组又进一步研究了γ射线低剂量照射(1Gy，2Gy，3Gy)小鼠尿液代谢轮廓随强度的变化。研究发现，包括胸苷和2＇-脱氧尿苷在内的脱氨嘌呤类和嘧啶类具有照射剂量和照射时间相关性[27]。考虑到尿液中一些高极性化合物在UPLC系统中不保留不易分离，该课题组又采用GC-MS方法对γ射线照射的大鼠尿液代谢产物进行了分析，发现尿液中乙醛酸、胸腺嘧啶、尿嘧啶、柠檬酸盐、2-酮戊二酸等的相对含量在照射组与非照射组明显不同。胸腺嘧啶和尿嘧啶由于是胸苷和2＇-脱氧尿苷的衍生物，与前期研究结果具有一致性。通过代谢路径分析发现，γ射线照射可能影响机体氧化应激和肾功能水平[28-30]。通过UPLC-QTOF/MS大鼠尿液代谢组学分析，又进一步证实了上述化合物作为γ射线辐射损伤啮齿类动物生物标志物的可能性[31]。为了进一步的将啮齿类实验数据与临床研究相关联，该课题组又对灵长类动物猕猴进行尿液辐射代谢组学研究[32]。研究发现牛磺酸、黄嘌呤、尿酸、肌酐等13个化合物对聚类贡献明显，并对这些化合物进行了进一步的靶标代谢组学研究，明确了其在辐射组与对照组之间的含量差异，并通过受试者工作特征曲线(ROC曲线)评估了其模型判别的准确性。然而在对前期潜在标志物进行靶标代谢组学分析发现，这些化合物均没有显著差异，分析结果一方面可能是由于物种之间差异的影响，另一方面提示我们非靶标代谢组学查找到的生物标记物需进一步经过定量验证来评估其准确性。

2.2代谢组学在非电离辐射研究中的应用随着微波技术的广泛应用，微波辐射作为非电离辐射的常见形式也逐渐得到关注。长期受到微波辐射的人员会出现精神抑郁、失眠、疲劳、头痛、激动、多梦、记忆力下降等症状[33]。王丽峰等[34]采用NMR代谢组学研究了微波辐射对猕猴尿液中代谢产物的影响。经5和11mM/cm2微波单次辐射和4．68μW/cm2微波30d累积辐射均能引起尿液代谢产物的变化，其差异代谢物包括马尿酸、柠檬酸、乳酸、甘氨酸、肌酸、肌酐、牛磺酸和苯丙氨酸等。这些代谢物质涉及三羧酸循环中间产物、氨基酸递质代谢产物等，其功能主要涉及线粒体、神经递质等，提示低剂量微波长期辐射和高剂量微波一次性辐射均对机体代谢产生影响。

3展望

代谢组学应用于辐射损伤的研究还处于初级阶段，仍然有许多问题需要解决。从近几年辐射代谢组学相关文献来看，代谢组学在辐射损伤中的研究，大多集中于生物标志物的探索阶段，在机制研究方面仍比较欠缺。从代谢组学的研究手段上来说，绝大部分仍停留在非靶标代谢组学的轮廓分析，对生物标志物的灵敏度与准确性没有进行进一步的定量验证，从而缺乏有的效说服力。同时，从上述分析中还可以发现，研究者没有将代谢组学数据与病理生理学研究结果进行有效的结合，在造模阶段缺乏有效的病理学数据进行支撑，在生物标志物验证过程，缺乏对差异化合物的波动原因进行有效阐释。但代谢组学在辐射损伤研究中全面、高通量、无偏差的优势不容忽视，随着研究的不断深入和代谢组学分析方法的不断规范，上述问题终将得到解决。代谢组学技术将在辐射损伤的诊断和机制研究以及辐射损伤防治药物研究中发挥积极作用，推动放射医学的发展。

[参考文献]

[1]于永红，高忠贤，张方清．电离辐射对职业照射生物效应影响的调查研究[J]．中国辐射卫生，2003，12(3) :185-186．

[2]周平坤．核辐射对人体的生物学危害及医学防护基本原则[J]．首都医科大学学报，2011，32(2) :1-5．

[3]王培民，吴龙，向颖，等．强电磁辐射对暴露人群健康的影响[J]．解放军预防医学杂志，2012，30 (6) :409-411．

[4]蔡广，王德文，李全岳，等．雷达微波对人体机能的影响[J]．华南国防医学杂志，2005，19(2) :31-33．

[5]胡海翔，丁浩浩，罗少波，等．微波辐射对雷达操作人员精子凋亡的影响[J].解放军医药杂志，2014，26(10) :94-96．

[6]熊国林，赵毅，邢爽，等．rhIL-12对恒河猴造血系统辐射防护作用的初步研究[J].中国实验血液学杂志，2013，21(1) :150-154．

[7]王月英，吴红英，李德冠，等．不同剂量137Csγ射线照射对小鼠造血系统的影响[J].国际放射医学核医学杂志，2013，37(1) :1-4．

[8]李春荣，林汝仙，王升启．“组学”在辐射损伤研究中的应用[J]．中华放射医学与防护杂志，2007，27 (3) :296-300．

[9]Nicholson J K，Connelly J，Lindon J C，et al.Metabonomics A platform for studying drug toxicity and gene function[J].Nat Rev Drug Discov，2002，l(2) :153-l61．

[10]Dunn W B，Broadhurst D，Begley P，et al.Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry[J].Nat Protoc，2011，6(7) :1060-1083．

[11]Want E J，Masson P，Michopoulos F，et al.Global metabolic profiling of animal and human tissues via UPLC-MS[J].Nat Protoc，2013，8(1) :17-32．

[12]Want E J，Wilson I D，Gika H，et al.Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS[J].Nat Protoc，2010，5(6) :1005-1018．

[13]Beckonert O，Keun H C，Ebbels T M，et al.Metabolic profiling，metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine，plasma，serum and tissue extracts[J].Nat Protoc，2007，2(11) :2692-2703．

[14]Yuan M，Breitkopf S B，Yang X，et al.A positive /negative ion-switching targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids cells and fresh and fixed tissue[J].Nat Protoc，2012，7(5) :872-881．

[15]Patti G J，Yanes O，Siuzdak G.Metabolomics the apogee of the omics trilogy[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2012，13:263-269．

[16]张再重，王瑜，王烈．N-乙酰半胱氨酸对辐射损伤防护作用的研究进展[J]．福州总医院学报，2010，17(1) :49-51．

[17]Kalpana K B，Devipriya N，Srinivasan M，et al.Investigation of the radioprotective efficacy of hesperidin against gamma-radiation induced cellular damage in cultured human peripheral blood lymphocytes[J].Mutat Res，2009，676(1-2) :54-61．

[18] 郝晓玲，吕秋军，周苗，等．补中益气丸等中成药的辐射防护作用[J]．中华放射医学与防护杂志，2006，26(4) :366-369．

[19]李报春，戴士勇．氧自由基对支气管哮喘患者β肾上腺素受体的影响[J]．中国综合临床，2003，19 (8) :712-713．

[20]蒙萍，马慧萍，景临林，等．线粒体靶向抗氧化剂MitoQ的研究进展[J]．解放军医药杂志，2014，26(12) :108-111．

[21]Cheema A K，Pathak R，Zandkarimi F，et al.Liver metabolomics reveals increased oxidative stress and fibrogenic potential in GFRP transgenicmice in response to ionizing radiation[J].J Proteome Res，2014，13，3065-3074．

[22]Rupak P，Amrita K C，Simina M B，et al.Modulation of radiation response by the tetrahydrobiopterin pathway[J]．Antioxidants，2015，4:68-81．

[23]Ahmad R K，Poonam R，Ritu T，et al.NMR spectroscopy based metabolic profiling of urine and serum for investigation of physiological perturbations during radiation sickness[J].Metabolomics，2011，7:583-592．

[24]李航，李鹏，谢梅，等．五麦党黄口服液对辐射损伤模型小鼠免疫功能的影响[J].中国药房，2014，24(47) :4442-4444．

[25]霍超，王穆，马增春，等．辐射损伤所致血虚证小鼠模型及四物汤反证的代谢组学研究[J].天津中医药，2010，27(3) :233-235．

[26]Tyburski J B，Patterson A D，Krausz K W，et al.Radiation metabolomics 1 identification of minimally invasive uurine biomarkers for gamma-radiation exposure in mice[J].Radiat Res，2008，170，1-14．

[27]Tyburski J B，Patterson A D，Krausz K W，et al.Radiation metabolomics 2 Dose-and time-dependent urinary excretion of deaminated purines and pyrimidines after sublethal gamma-radiation exposure in mice[J].Radiat Res，2009，172，42-57．

[28]Lanz C，Patterson A D，Slavík J，et al.Radiation metabolomics.3.Biomarker discovery in the urine of gamma-irradiated rats using a simplified metabolomics protocol of gas chromatography-mass spectrometry combined with random forests machine learning algorithm[J].Radiat Res，2009，172(2) ，198-212．

[29]陆培华，时开网，刘子君，等．蛙皮素对胆道梗阻大鼠肝脏氧化应激的影响[J].中华消化外科杂志，2006，5(6) :443-446．

[30]薛冰，矫健，张雷，等.雷公藤单体T10 对过氧化氢所致PC12 细胞损伤的保护作用及其机制的研究[J].中华神经医学杂志，2006，5(12) :1194-1198．

[31]Johnson C H，Patterson A D，Krausz K W，et al.Radiation metabolomics 4 UPLC-ESI-QTOF/MS-based metabolomics for urinary biomarker discovery in gamma-irradiated rats[J].Radiat Res，2011，175(4) ，473-484．

[32]Johnson C H，Patterson A D，Krausz K W，et al.Radiation metabolomics 5 Identification of urinary biomarkers of ionizing radiation exposure in nonhuman primates by mass spectrometry-based metabolomics[J].Radiat Res，2012，178(4) ，328-340．

[33]Salama N，Kishimoto T，Kanayama H O.Effects of exposure to a mobile phone on testicular function and structure in adult rabbit[J].Int J Andro，2008，33(1) :88-94．

[34]王丽峰，李翔，彭瑞云，等．基于代谢组学对微波辐射后猕猴尿液代谢产物的筛选研究[J].军事医学，2011，35(5) :369-378．

(收稿时间:2015-09-20 修回时间:2015-10-20)

[文献标志码][中国图书资料分类号] R818.74 A

[文章编号]2095-140X(2015) 12-0113-04

[通讯作者]童卫杭，E-mail:sonatawh@163.com

[基金项目]全军医学科技青年培育项目(14QNP072)

[DOI]10.3969 /j.issn.2095-140X.2015.12.026