蛋白质组学在结直肠癌生物学特性研究中的意义

柴晓玲，陆建波

（昆明医科大学第一附属医院病理科，云南昆明 650032）

结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤。近年来结直肠癌患者的发病率、病死率有了明显降低，生存率和生活质量有了极大提高。这无不与近年来在肿瘤临床研究中广泛采用分子生物学技术密切有关，特别是对结直肠癌生物学特性的探讨，揭示了结直肠癌发生发展过程中的肿瘤细胞生长特点、增殖与凋亡能力、侵袭与转移机制及肿瘤细胞抗药性机制。肿瘤病理学的研究，已不单纯从病理组织形态学、免疫组织化学上去分析，而结合多种新技术如原位杂交、基因扩增、基因测序等分子病理检测技术，尤其是近年来快速发展的组学技术，包括基因组学、蛋白质组学和代谢组学。

肿瘤的发生发展是多基因参与的复杂过程，而基因功能的发挥是通过蛋白质实现的。肿瘤细胞的增殖与凋亡，不仅决定了肿瘤的发生发展，而且一定程度上影响了肿瘤的侵袭与转移。某些蛋白质的改变打破了细胞正常的凋亡与增殖之间的平衡，参与了肿瘤的发生发展和浸润转移［1］。而且发现肿瘤对众多化疗药物产生耐药性，大部分与某些结构蛋白的改变相关［2］。因此，基因组学和蛋白质组学的研究将会有助于从源头上揭示肿瘤的生物学特性变化规律及原因。

1 结直肠癌发生发展过程中蛋白质组学研究

结直肠组织从正常到癌变，可出现一系列蛋白质异常表达。如与能量代谢有关的蛋白质酰基辅酶A脱氢酶和琥珀酸脱氢酶过氧化物还原酶6表达明显下调，糖酵解相关蛋白二磷酸果糖酶表达明显上调［3］。染色体重构蛋白的异常表达在结肠肿瘤的形成中也有不容忽视的作用，作为染色体重构蛋白的一员，Rsf-1的扩增产物可以诱导染色体不稳定，进而引发肿瘤形成［4］。在结肠癌发展过程中，可出现微管蛋白（end-binding protein）EB1表达上调，同时伴随Adenomatous polyposis coli（APC）蛋白表达下调，通过siRNA技术，发现EB1和APC共同调节纺锤体有丝分裂、染色体校准和微管稳定性。当APC与EB1相互作用发生异常时，包括APC突变或EB1过度表达，会出现染色体异常分离，肿瘤细胞增多［5］，加速结肠癌的发展。

Caveolin-1（CAV-1）是caveolae的主要成分，是相对分子质量21～24 ku的蛋白质。大部分结肠癌细胞中CAV-1蛋白质水平明显降低，裸鼠成瘤实验中发现，CAV-1的过度表达可以减缓肿瘤的形成，说明它的表达可以负性调控肿瘤的发生发展［6］。

结直肠癌发生发展过程中，有多种蛋白质发生改变，这些改变的蛋白质可以相互作用、相互影响和不断发生变化。蛋白质组学就是要研究各种蛋白质变化的时序和在肿瘤发生发展过程起主导作用的蛋白质及蛋白质组的变化规律，从而寻求能够抑制或拮抗肿瘤细胞蛋白质的方法，达到治疗肿瘤的目的。

2 结直肠癌侵袭转移的蛋白质组学研究

结直肠肿瘤的侵袭转移是肿瘤致死的主要原因，蛋白质组学技术是探讨肿瘤侵袭转移相关蛋白质的有效手段。通过蛋白质组学技术发现38种蛋白质在原发性结肠癌和结肠癌淋巴结局部转移的组织中差异表达。其中FXYD3和S100A11表达明显下调，GSTM3表达明显上调，与淋巴结局部转移密切相关［7］。

曾有学者用血小板悬浮液培养结肠癌细胞，通过蛋白免疫印迹实验发现血小板可以刺激P38 MAPK磷酸化，上调基质金属蛋白酶MMP-9蛋白水平。当沉默含血小板培养的肿瘤细胞中的P38，发现MMP-9水平下调，认为P38 MAPK调控MMP-9的表达。所以，在含有血小板的培养基中进行结肠癌细胞培养，血小板产生的血小板反应蛋白和丛生蛋白通过激活P38/MAPK信号通路，可以增强MMP-9的活性，进一步促进结肠癌细胞的侵袭和转移［8］。

3 结直肠癌细胞增殖与凋亡的蛋白质组学研究

肿瘤细胞的增殖与凋亡贯穿肿瘤发生发展的始终，这是研究肿瘤的发病机理及浸润转移的最重要线索，其相关蛋白也是治疗肿瘤的靶点。当调控细胞增殖与凋亡的相关蛋白质发生改变，会促进或抑制肿瘤的形成。异源三聚体G蛋白是水解酶家族的一员，它包括Gα和Gβγ亚单位，其中Gβ5可以作为NF-κB转录的辅助因子，而NF-κB信号通路在调节细胞增殖方面有重要意义。另外，Gβ5可以诱导抗凋亡蛋白XIAP产生，而XIAP可以激活NF-κB信号通路。由此推测，Gβ5是通过诱导抗凋亡蛋白XIAP产生和激活NF-κB信号通路来调控结肠癌细胞的增殖［9］。JMJD6，一种 Jumonji C domain-containing蛋白，可以作为酮戊二酸赖氨酰基羟化酶，催化P53的赖氨酸382发生羟基化，对抗P53乙酰化，促进P53与它的负性调控者MDMX结合，抑制P53的转录活性。进一步通过siRNA技术，发现JMJD6的沉默可以增加P53的转录活性，细胞阻滞在G1期，细胞凋亡数增加［10］。所以，JMJD6具有促进细胞增殖的功能。

通过2D双向凝胶电泳技术和质谱技术分析结直肠癌组织和正常组织的蛋白质表达谱，发现36种蛋白质差异表达，其中碳酸酐酶Ⅱ（CAⅡ）改变最明显，它在结直肠癌组织中表达明显下调。建立碳酸酐酶Ⅱ过度表达的结直肠癌细胞SW480，发现细胞周期停滞在G0/G1和G2期［11］，进而抑制细胞增殖。SERPINA3K，又称激肽释放酶相关蛋白（KBP），是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂。它可以激活外源性死亡路径，在含SERPINA3K的培养基中，发现Fas配体蛋白水平上调。当Fas配体蛋白下调时，发现SERPINA3K诱导的细胞凋亡受到阻碍，可见SERPINA3K诱导肿瘤细胞凋亡依赖于Fas配体蛋白的表达。进一步通过免疫印迹实验发现，SERPINA3K是通过上调PPARγ蛋白水平激活Fas/FasL路径，诱导细胞凋亡［12］。

4 结直肠癌对药物产生耐药性的蛋白质组学研究

肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性，严重影响了治疗效果。以往对耐药机制的研究多在基因水平，而蛋白质组学技术从另一角度揭示了耐药机制。研究发现牛磺酸转运子SLC6A6，这是一种多通道膜蛋白，它与肿瘤细胞对5氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）、阿霉素（doxorubicin，DOX）和喜树碱类（SN-38）多种化疗药物耐药密切相关。多药耐药的主要原因是 ATP绑定盒（ABC）转运子如 MDR1或ABCG2的过度表达。在SLC6A6沉默的细胞中，发现ABC转运子的活性处于激活状态，但ABC转运蛋白MDR1和ABCG2的表达和功能均无变化，而且药物的活性也未减弱，说明这种细胞对由化疗药物介导的凋亡是敏感的。但在SLC6A6高表达的细胞中，它不但能够对抗由化疗药物引起的凋亡，还能直接抵抗细胞凋亡。所以，SLC6A6的过度表达导致结肠癌细胞对化疗药物产生耐药性［13］。PEA-15蛋白是一种多功能的小磷蛋白，它的高表达可以对抗死亡配体TRAIL的表达和由化疗药物引起的细胞毒性，增加肿瘤细胞的耐药性［14］。

肿瘤抑制蛋白FOXO3A，通过上调促凋亡基因P21、PTEN、Bim和 GADD45的转录活性，增加 Bax依赖的细胞凋亡能力，降低肿瘤细胞的生存能力，进而提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［15］。HIV-1病毒蛋白R（VPR）是含96种氨基酸的14 ku的蛋白质，它通过调控细胞周期停滞在G2期，促进Bax蛋白的表达，加强线粒体细胞色素C的释放，降低Bcl-xl蛋白的表达，抑制NF-κB的激活，加速细胞凋亡，导致肿瘤细胞耐药性降低［16］。质谱分析经姜黄素和伊立替康处理的结直肠癌细胞LOVO，出现54种差异蛋白质的表达。通过研究发现过氧化物还原酶4和蛋白二硫化物异构酶的差异表达意义重大。由于二硫化物对于维持蛋白质稳定性发挥重要作用，而姜黄素和伊立替康可以通过影响过氧化物还原酶4和蛋白二硫化物异构酶协同作用的发挥，破坏二硫化物形成，导致细胞LOVO凋亡，减少耐药性的产生，加强治疗效果［17］。

目前利用蛋白质组学技术的研究，主要是比较正常细胞与肿瘤细胞之间的差异蛋白质，并对不同时期的肿瘤细胞中表达蛋白质的种类进行定性和定量分析。所采用的技术有2D双向凝胶电泳技术（Two-dimensional gel electrophoresis，2-DGE）、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术（matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）、电喷雾串联质谱技术（electrospray tandem mass spectrometry，ESI MS/MS）等，尤其后者在不破坏蛋白质结构的情况下对样品进行大量精确的测定。然而蛋白质组学是一门新学科，技术还不成熟，在分离和鉴定肿瘤标志物方面还处于初级阶段，对低丰度蛋白质的检测能力还不足，但结直肠癌发生发展过程中低丰度蛋白质的表达具有重要意义。另外，测定差异蛋白质的灵敏度和特异性及所测定的蛋白质种类的信息量还有待进一步提高。

随着科技的发展，基因组学与蛋白组学技术的成功联合运用，特别是在结直肠肿瘤病因学与早期阶段肿瘤细胞蛋白质变化规律的研究，寻找到一组能够阻断肿瘤细胞异常增殖与凋亡的关键蛋白质，为临床肿瘤治疗带来新的曙光。

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