脑缺血再灌注中一氧化氮对神经元凋亡的影响

边经纬，李俊发，罗艳琳*

(首都医科大学1.2011级基础医学专业;2.神经生物学系，北京100069)

对心[1]、肺[2]、肝[3]等器官缺血再灌注相关的研究显示，不同含量的一氧化氮(nitric oxide，NO)在细胞凋亡中作用不同。脑缺血再灌注中NO 作用也随含量变化表现出不同[4]。本文对近几年相关文献进行综述，以进一步明确NO 在脑缺血再灌注损伤中的作用。

1 概述

脑缺血再灌注损伤的机制较为复杂，参与因素众多，包括氧化应激[5]、钙超载[6]和炎性反应[7]等。及时恢复缺血部位血流，有可能挽救脑细胞，有助于脑功能恢复，但也可能引起严重的再灌注损伤[8]。

脑缺血再灌注过程中，损伤核心区以细胞坏死为主;周围区有多种细胞损伤形式，包括凋亡、自噬和程序性坏死。其中细胞凋亡现象较为明显[9]。细胞凋亡具有主动性与可逆性，这是减轻脑缺血再灌注后神经元损伤的关键。

2 NO对细胞凋亡的作用

诸多因素影响脑缺血再灌注引起的神经元凋亡，其中NO 既可作为内源性物质由机体本身生成，又可作为外源性物质由其供体向机体提供，故备受关注。

2.1 脑缺血再灌注过程中NO含量的变化

脑缺血再灌注过程中，NO含量随着缺血时间及再灌注时间的变化而变化。

脑缺血期间，随着缺血开始，海马内NO含量迅速下降，并在10 min 左右达到最低值[10]。缺血15 min NO含量逐步升高，缺血30 min时达到峰值，缺血90～120 min时NO含量明显下降[11]。

用脑缺血30 min的模型来研究再灌注发现，脑组织在再灌注30 min后NO含量再次升高，随后NO含量逐步上升，达到峰值后含量下降[12-13]。对于再灌注期间NO含量达到峰值的时间点，不同研究结果存在部分差异，有研究发现再灌注6 h时NO含量达到峰值[13];也有报道再灌注72 h时才达到峰值[12]。

综上所述，脑缺血过程中脑组织NO含量逐渐升高达到一定峰值后逐渐下降;再灌注后，NO含量再次升高达到峰值后含量下降，呈“双峰样”变化。

2.2 NO对细胞凋亡的双重作用

与单纯缺血90 min 再灌注24 h 大鼠相比，缺血再灌注后腹腔注射7，8-二羟黄酮(7，8-dihydroxyflavone，7，8-DHF)大鼠缺血组织中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)活性受到抑制，NO含量和神经元凋亡数目明显减少，推测NO含量减少在脑缺血再灌注过程中起保护作用[14]。同时，有报道认为NO含量增多是诱导神经元凋亡，加重脑损伤的机制之一[15]。可见，脑缺血再灌注过程中，NO含量增加，加重神经元损伤产生神经毒性，促进细胞凋亡，甚至导致神经元坏死;适当降低NO含量可以有效抑制细胞凋亡，对损伤脑组织起保护作用。

3 NO 影响细胞凋亡的相关信号通路

NO对细胞凋亡的影响与一些信号传导通路相关，可通过调控这些信号通路来影响细胞凋亡。

3.1 死亡受体介导的细胞凋亡信号通路

死亡受体通路是一种外源性途径，细胞内Fas信号调节被人们高度重视。其中，Fas的膜表达、聚集和内化是死亡诱导信号传导复合体(death-inducing signaling complex，DISC)和hiDISC(含高分子聚合体CD95hi)形成的关键，也是Fas 信号通路的核心。

研究发现，大鼠全脑缺血再灌注6 h时，NO含量达到峰值，胞质中Fas 减少达到最低水平，细胞膜上Fas表达增加达到峰值，表明Fas 从胞质移位到细胞膜;同时胞质中代表Fas 聚集的CD95hi明显增加且达到峰值，表明缺血再灌注过程诱导Fas 膜表达和聚集;进一步发现缺血再灌注6 h时海马CA1区hiDISC 和DISC的形成显著增加[16]。由此推测NO 可以通过死亡受体介导信号通路影响细胞凋亡。

3.2 线粒体介导的细胞凋亡信号通路

脑缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡过程中，线粒体的作用尤为重要[17]。

氧糖剥夺及复氧(oxygen-glucose deprivation followed by recovery，OGD/R)后原代神经元的线粒体膜电位和ATP 水平下降，线粒体复合物活性降低，说明OGD/R 可以使线粒体完整性受到破坏，功能受到抑制;进而发现，OGD/R 降低了线粒体内的凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor，AIF)和细胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)含量，增加了细胞系内AIF 和胞质Cyt-C水平，说明AIF 发生核移位，Cyt-C从线粒体内释放;同时，核浓缩和核碎片现象明显;提示OGD/R 可以激活线粒体介导的信号通路，促进细胞凋亡。作者使用一种NO 供体预处理后发现，OGD/R 诱导线粒体介导的神经元凋亡受到明显抑制，推测该供体对缺血性神经元损伤的神经保护作用与NO 有关[18]。

可见，NO 可以影响线粒体功能和其膜的通透性，激活线粒体介导的信号通路，促进细胞凋亡。

3.3 内质网介导的信号通路

除上述研究外，在短暂性脑缺血过程中，脑组织内的NO 可以诱导内质网(endoplasmic reticulum，ER)钙泵失活，导致ER 腔内Ca2+浓度失衡，引起ER 功能障碍，从而触发内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress，ERS)。一定程度的ERS 可增强ER 应激能力，促进ER 功能恢复;而ERS 持续存在或过强时将诱导ERS 相关性细胞凋亡，造成组织损伤[9]。

3.4 JNK信号通路

JNK信号通路是以c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)家族为中心的细胞信号传导通路，可被细胞因子、生长因子及缺血再灌注等多种因素激活[19]。

对大鼠全脑缺血15 min 再灌注3 d的模型研究时发现，海马CA1 组织内S-亚硝基化的JNK3 与磷酸化的JNK3 有明显升高，并伴有凋亡现象的增加;使用NOS 抑制剂可以降低JNK3 S-亚硝基化和磷酸化水平，推测缺血再灌注产生的内源性NO 可以使JNK3 发生S-亚硝基化和磷酸化，促进神经元凋亡。进一步研究发现NO 供体硝普钠可以抑制JNK3 发生S-亚硝基化和磷酸化，抑制细胞凋亡与坏死[20]。因此，外源性NO 可以抑制内源性NO 诱导JNK3 发生的S-亚硝基化来降低JNK3 活性，从而影响JNK信号通路起到保护作用。

4 NO的分子修饰

最新研究发现，NO 可以使相关蛋白发生S-亚硝基化，改变蛋白活性来调控上述信号通路，影响细胞凋亡。

大鼠全脑缺血后再灌注6 h时，NO含量达到峰值，Fas的S-亚硝基化量与其相一致;如果在缺血前使用神经型NOS 抑制剂，Fas的S-亚硝基化即受到明显抑制，推测nNOS 活化产生的NO 诱导了Fas的S-亚硝基化。由于Fas的膜表达，聚集和内化是DISC 和hiDISC 形成和凋亡诱导蛋白激活的关键，故推测Fas的S-亚硝基化影响了死亡受体介导的信号通路，从而影响细胞凋亡[16]。

对缺氧缺血的鼠脑海马区中S-亚硝基化的细胞凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)含量分析发现，缺血再灌注后ASK1的S-硝基化水平升高，若缺血前使用NOS 抑制剂可明显抑制再灌注后ASK1的S-亚硝基化，推测NO 诱导ASK1 发生S-亚硝基化，影响JNK信号通路[21]。

缺血再灌注还可以激活谷氨酸受体6(glutamate receptor 6，GluR6)介导的JNK信号通路，通过对比缺血再灌注鼠脑和使用NOS 抑制剂处理的鼠脑组织中GluR6 S-亚硝基化水平证明NO 可使GluR6 S-亚硝基化，推测GluR6 被NO 亚硝基化后活性发生改变，从而调节了JNK 通路，影响神经元的细胞凋亡[22];总之，NO 可以通过S-亚硝基化的分子修饰影响JNK信号通路。

5 展望

目前已经发现脑缺血再灌注中NOS 影响细胞凋亡过程。其中大量研究发现活化nNOS 产生的NO 可影响细胞凋亡;还发现iNOS 和eNOS 在细胞凋亡过程中的作用也至关重要，因此，3种NOS 对细胞凋亡影响的不同机制及关键信号靶点值得深入研究。

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