盐霉素抗癌细胞及癌干细胞作用的研究进展

许 宁，欧仁杰，王晓庆，张会朋，石爱平

（1.吉林大学第一医院泌尿外科，吉林 长春 130021；2.玲珑英诚医院外科，山东 招远 265400；3.吉林大学第一医院普外科，吉林 长春 130021）

盐霉素 （salinomycin）是上世纪70年代初宫崎等［1］从白色链霉菌 （菌株号：No.80614）中提取的1元羧酸聚醚类小分子化合物，同时也是具有生物活性的新型抗生素。其分子式为C42H70O11，分子表面具有亲脂性，内部包含氧原子和1个羧基的离子载体［2］。盐霉素对细胞中的阳离子，尤其K＋和Na＋的亲和力特别强，使生物所必需的阳离子通过膜上脂质屏障的浸透性增强，阻碍细胞内外阳离子的传递，导致细胞内外离子浓度发生变化［3］。这些生物学特性使盐霉素对革兰阳性菌、部分丝状真菌、疟原虫及引起家禽疾病的球虫类生物有抑制作用，被用于防治家禽的球虫病和提高反刍动物的饲料吸收率。2009年，Gupta等［4］首次在 《Cell》杂志上发表了盐霉素能够选择性杀死乳腺癌干细胞的文章，这一发现具有较为深远的意义。在此基础上，研究者［5－16］用盐霉素与多种不同的癌细胞及癌干细胞进行研究，结果均表明盐霉素能够抑制多种癌细胞及癌干细胞的生长及转移，并诱导其凋亡。

1 盐霉素抗癌细胞及癌干细胞的作用机制

近年来，通过盐霉素对多种癌细胞及癌干细胞体外及体内实验研究［5－16］发现：盐霉素对癌细胞及癌干细胞的抑制作用主要通过以下几种机制来实现：①抑制 Wnt／β－catenin信号途径。目前的研究认为 Wnt／β－catenin信号途径在癌干细胞发生发展中具有重要作用，而盐霉素是通过对 Wnt／β－catenin信号途径中相关蛋白及 Wnt／β－catenin信号途径的靶基因及蛋白表达抑制来实现对癌细胞及癌干细胞增殖及转移的抑制作用；②诱导癌细胞及癌干细胞中凋亡蛋白表达增加，克服癌细胞及癌干细胞的凋亡抵抗作用，促进细胞凋亡；③诱导癌细胞及癌干细胞氧化应激反应，增加细胞中的活性氧 （ROS）水平，从而诱导细胞凋亡。

2 盐霉素抗癌作用及相关机制

2.1 盐霉素与乳腺癌 2009年，Gupta等［4］发现盐霉素能够选择性杀伤乳腺癌HMLEshEcad细胞株中CD44high／CD24low细胞，经盐霉素处理后HMLEshEcad细胞株中CD44high／CD24low细胞数量为紫杉醇对照组细胞数量的1／360；应用基因组富集分析法检测分析盐霉素作用后的乳腺癌细胞中侵袭性基因组，发现CD44／CD24基因组和乳腺微球基因组表达水平降低。在裸鼠体内实验中，盐霉素作用组较紫杉醇作用组乳腺癌干细胞成瘤及转移能力降低100多倍。Björklund等［5］和 Liu等［6］认为：LRP5和 LRP6受体是 Wnt／β－catenin信号途径中的致瘤蛋白，在以 Wnt／β－catenin信号途径为主发生的肿瘤中具有重要作用。异常表达的LRP5剪接异构体被发现与乳腺癌的形成有关，同时，LRP6亦被发现在乳腺恶性肿瘤中的表达异常增高。异常增高表达的LRP6能够导致小鼠乳腺增生，下调LRP6则能够降低乳腺癌的发生率，同时糖原合成酶激酶3、酪蛋白激酶1γ等则在LRP6的磷酸化中发挥重要作用。Zhang等［7］在对盐霉素与乳腺癌的体内与体外研究中发现：盐霉素与紫杉醇联合应用可以更有效地治疗乳腺癌。三阴乳腺癌预后较差，2012年King等［8］的研究发现：三阴乳腺癌预后较差主要是由于乳腺癌细胞中存在乳腺癌干细胞。近年来的研究［4－8］表明：Wnt／β－catenin途径在乳腺癌的发生发展中发挥重要作用，而盐霉素已经被证实是 Wnt／β－catenin途径抑制剂，盐霉素对Wnt／β－catenin途径的抑制作用在对乳腺癌及癌干细胞的抑制作用中可能发挥关键作用。

2.2 盐霉素与胃癌 Zhi等［9］在对盐霉素与胃癌细胞的体外实验研究中发现：首先检测胃癌细胞株 NCI－N87、SNU－1、SGC－7901 和 BGC－823 细 胞 表 面 ALDH、Sox2、Nanog和Nestin干细胞分子标志物，证明了NCI－N87和SNU－1细胞株为 ALDH 高表达，SGC－7901和BGC－823为ALDH低表达。然后通过细胞集落实验及悬浮球实验证明高表达ALDH的细胞比低表达ALDH的细胞克隆形成能力及成球能力强，干细胞特性更明显。最后将ALDH高表达和低表达的胃癌细胞分组，分别加入5－Fu、CDDP和盐霉素进行药物抵抗实验，结果表明：高表达ALDH的胃癌细胞在传统化疗药物5－Fu和CDDP中存活及成球率较高，但对盐霉素较为敏感，存活及成球率较低，而且盐霉素对ALDH高表达胃癌细胞抑制作用效果是ALDH低表达胃癌细胞的4倍，提示盐霉素对耐药作用较强的胃癌干细胞抑制作用明显。Zhi等［9］研究证明了盐霉素对胃癌干细胞的抑制作用，并对胃癌敏感化疗药物的选择具有重要指导作用。Mao等［10］在对胃癌干细胞的研究中发现：Wnt／β－catenin信号途径能够促进胃癌干细胞在体内及体外的增殖，并在癌干细胞的自我更新中可能发挥重要作用；通过抑制 Wnt／β－catenin信号途径能够抑制胃癌干细胞的增殖。

2.3 盐霉素与结直肠癌 Dong等［11］认为：结直肠癌治疗及预后效果较差是因为存在癌干细胞，并进行体外实验以证明其观点。实验选取结直肠癌HT29和SW480细胞株，这2种细胞表面分别高表达及中等程度表达CD133＋，具有结直肠癌干细胞特性。实验利用CCK－8试剂盒检测盐霉素作用后的癌干细胞活力，结果提示2种干细胞活力均下降；流式细胞术检测发现CD133＋细胞亚种群所占比例减少；软琼脂和Boyden分析显示2种癌干细胞克隆形成和迁移能力降低；利用免疫荧光染色、RT－PCR及蛋白印迹实验检测分子学变化，结果表明：盐霉素促进了HT29和SW480细胞株凋亡，减少了CD133＋细胞亚种群所占比例，降低了HT29和SW480细胞克隆形成能力及细胞活性，增加了E－钙黏蛋白相关基因及蛋白表达量。现已证实E－钙黏蛋白表达增加能抑制上皮间质转化 （MET），而这种转变能使上皮癌细胞表现出癌干细胞的特性及侵袭性。因此Dong等通过体外实验证明了盐霉素能够降低结直肠癌干细胞MET，推断盐霉素可能是抑制结直肠癌干细胞潜在的有效药物。

2.4 盐霉素与前列腺癌 2011年Kim等［12］对盐霉素与前列腺癌进行了体外实验研究，结果显示：盐霉素作用后的前列腺癌细胞活性明显降低，而正常前列腺细胞活性不受影响。进一步研究发现：盐霉素作用后的前列腺癌细胞中逃避细胞凋亡程序相关蛋白Bcl－2水平降低，促凋亡蛋白Bax水平升高，PARP－1裂解，凋亡酶caspase－3被激活，同时发现前列腺癌细胞中ROS水平明显增加，而ROS水平的增加可以通过多种途径来诱发细胞的凋亡。Ketola等［13］则通过体外实验进一步研究了盐霉素与前列腺癌及癌干细胞的关系，结果显示：盐霉素能够抑制由VCaP和LNCa细胞中分离出的前列腺癌干细胞中ALDH－1及CD44的表达，并且降低VCaP和LNCa细胞中干细胞比例，实验结果表明：盐霉素不仅能促进前列腺癌细胞的凋亡，还能抑制前列腺癌干细胞的增殖。

2.5 盐霉素与胰腺癌 Lei等［14］在盐霉素与胰腺癌的体外研究中发现：盐霉素作用后癌细胞中CD133＋细胞亚群比例减少，同时检测到促凋亡蛋白Bax和E黏钙蛋白的表达量明显上调，且能够使细胞异常增殖的Bcl－2和PCNA的表达量明显降低；Wnt／β－catenin途径中相关蛋白β－catenin和p－GSK－3β的表达受到抑制。研究者推测盐霉素对胰腺癌的抑制作用可能与 Wnt／β－catenin途径有极为密切的关系。Zhang等［15］则采取联合药物实验检测盐霉素对胰腺癌细胞及癌干细胞的作用。研究者首先利用荧光激活细胞分选技术 （FACS）从 SW1990和 AsPC－1细 胞 株 中 分 选 出CD133＋细胞、CD133－细胞、SP细胞和NSP细胞，并采用盐霉素和吉西他滨分别作用于CD133＋细胞、CD133－细胞、SP细胞和NSP细胞，通过MTT比色法检测盐霉素和吉西他滨对上述细胞的毒性作用，结果显示：盐霉素对CD133＋细胞和SP细胞的毒性作用明显强于对CD133－细胞的毒性作用，而吉西他滨则显示出对CD133－细胞及NSP细胞较强的毒性作用，提示盐霉素能更有效地杀伤胰腺癌干细胞及具有干细胞特性的SP细胞而吉西他滨则无此效果。在联合盐霉素及吉西他滨作用于CD133＋细胞、CD133－细胞、SP细胞和NSP细胞实验中，通过MTT比色法检测2种药物联合后对癌细胞及癌干细胞的毒性作用，结果显示：盐霉素和吉西他滨联合作用能有效地杀伤CD133＋细胞、CD133－细胞、SP细胞和NSP细胞，并且作用效果明显优于单一药物使用。最后研究者通过裸鼠体内实验发现：盐霉素和吉西他滨联合应用比单一使用盐霉素或吉西他滨能够更有效地抑制裸鼠体内肿瘤的生长。Lei等［14］和Zhang等［15］的研究发现：盐霉素对胰腺癌细胞及癌干细胞具有抑制作用，且联合吉西他滨作用效果更为明显，这为胰腺癌治疗提供了一个新的思路，可能会取得较为理想的效果。

2.6 盐霉素与肝癌 Wang等［16］采用盐霉素与肝癌细胞株（HepG2，SMMC－7721，BEL－7402）进行研究。在体外实验中肝癌细胞增殖降低、凋亡增加，CD133＋的干细胞亚群比例减少；Bcl－2、GSK－3β和β－catenin相关基因和蛋白的表达量减少。体内实验结果显示：裸鼠肝脏肿瘤中的肝小叶结构遭到破坏；盐霉素实验组细胞凋亡率高于对照组，且治疗组较对照组 Bax／Bcl－2比值升高，p－GSK－3β表达降低但是GSK－3β总量不变，β－catenin相关蛋白表达减少。体内体外实验结果均表明：盐霉素能够明显促进肝癌细胞的凋亡且抑制增殖。研究者［17－18］认为：这与Bcl－2家族基因表达下降和Bax表达增加有关。Bcl－2家族在癌细胞逃避细胞凋亡程序中发挥重要作用，而Bax则能促进细胞凋亡。研究者［16］还发现盐霉素作用后的肝癌细胞中 Gsk－3β使β－catenin表达量下降。已有多篇文献［19－20］证明：Wnt／β－catenin途径中β－catenin蛋白的表达与肝癌细胞的凋亡关系密切。Wang等［16］在应用流式细胞术对肝癌细胞中CD133＋细胞亚群分析中发现：CD133＋细胞亚群比例降低。而肝癌细胞中CD133＋细胞具有癌干细胞特性［21－23］。这些研究表明：盐霉素不仅对肝癌细胞具有抑制作用，且对肝癌干细胞也有抑制作用。

2.7 盐霉素与卵巢癌 Parajuli等［24］采用盐霉素与卵巢癌细胞株 （A2780和A2780cis）进行的体外实验研究中首次提出并证明了盐霉素能够抑制卵巢癌Akt／NF－kB途径并导致癌细胞的凋亡增加，实验发现：盐霉素能够抑制卵巢癌细胞中Akt蛋白激酶，使NF－κB的表达降低，从而导致了细胞凋亡。为了证明Akt在细胞凋亡中作用，Parajuli等［24］采用siRNA转染以静默Akt相关基因，同样使卵巢癌细胞凋亡增加。在细胞周期分析中发现：盐霉素能够使亚G 1期卵巢癌细胞比例增高，而成熟卵巢癌细胞比例降低。卵巢癌细胞株A2780cis能够抵抗顺铂类药物，Parajuli等［24］的实验发现：盐霉素作用后A2780cis细胞凋亡增加，提示其对顺铂药物耐药的卵巢癌细胞具有较好的杀伤效果。Zhang等［25］进行卵巢癌细胞OV2008的体内和体外实验研究，提出盐霉素是通过调节P38MAPK以实现促进细胞凋亡的作用。这提示盐霉素对卵巢癌的抑制作用可能是通过多种途径实现的。

2.8 盐霉素与肺癌 Arafat等［26］在非小细胞肺癌细胞LNM35和A549细胞株的体外研究中发现：盐霉素能够抑制并促进其凋亡，并且具有时间－剂量相关性。肺癌具有较高的远处转移及局部浸润性，肺癌的治疗及预后效果极差。而Arafat等［26］在研究中发现：盐霉素可以促进NAG－1 mRNA及NAG－1蛋白的表达，使LNM35和A549细胞株的侵袭及转移能力降低，并且这种作用与NAG－1蛋白的水平呈正相关关系。为了证明盐霉素对癌细胞转移及侵袭能力的作用是通过NAG－1蛋白来实现的，研究者构建了NAG－1基因静默细胞，使NAG－1蛋白不能表达，然后采用5μmol·L－1盐霉素处理，结果显示：盐霉素不能抑制癌细胞的侵袭作用，甚至会出现反作用。Wang等［27］进行的A549细胞株体外实验证明：盐霉素能够明显减少肺癌细胞的成球率，并能降低Oct－4、胚胎干细胞关键蛋白Nanog及Sox2水平，表明盐霉素能够抑制肺癌干细胞生长。曾葭等［28］在盐霉素与耐顺铂肺癌细胞株A549／DDP体外实验中，通过流式细胞术检测盐霉素作用后的A549／DDP细胞株，结果显示：线粒体膜电位下降、细胞色素C和Ca＋释放增加，细胞中ROS水平增加；同时Bcl－2／Bax比值显著降低，且β－catenin和LRP6蛋白表达降低。表明盐霉素不仅可以通过诱导细胞内氧化应激增加实现对耐顺铂肺癌A549／DDP细胞株的促凋亡作用，同时可以通过抑制 Wnt途径以实现对耐顺铂肺癌A549／DDP细胞株的生长抑制作用。这些研究成果提示：盐霉素可能成为一个很有前途的肺癌化疗药物，为临床肺癌治疗提供新的方案。

2.9 盐霉素与膀胱癌 Ou等［29］对盐霉素与人膀胱癌5637细胞进行了体外实验研究，采用MTT比色法发现盐霉素作用后膀胱癌细胞存活率显著降低；应用流式细胞技术发现盐霉素作用后膀胱癌5637细胞凋亡率升高；通过体外Matrigel实验显示膀胱癌5637细胞的转移及侵袭能力降低；通过蛋白印迹实验显示Wnt／β－catenin途径中关键蛋白β－catenin表达量下降，结果证明：盐霉素对人膀胱癌5637细胞的生长有较明显抑制作用，能促进癌细胞凋亡，降低癌细胞侵袭力，并且这种抑制作用可能是通过抑制Wnt／β－catenin信号传导途径实现的。这些实验结果为膀胱癌的治疗提供了新思路。

2.10 盐霉素与白血病 2011年Lu等［30］在盐霉素与慢性淋巴细胞白血病体外研究中发现：盐霉素能够促进HEK293细胞凋亡，盐霉素能够通过结合Wnt1使脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）磷酸化，导致LRP6的分解减少，证明盐霉素是通过下调Wnt途径LRP6水平以实现促进细胞凋亡的作用，同时结果显示：盐霉素能够下调如LEF1、cyclin D1和纤维蛋白等Wnt靶基因及相关蛋白的表达，表明盐霉素对HEK293细胞作用主要是通过对Wnt途径发挥作用来实现的。Fuchs等［31］在盐霉素克服凋亡抵抗的体外研究中发现：盐霉素可以促进急性T淋巴细胞白血病患者外周血分离的CD4＋T细胞大量凋亡，而正常的淋巴细胞则不受影响。首先将盐霉素作用于人急性淋巴母细胞白血病细胞 （MOLT－4）及人外周白血病T细胞 （Jurkat），发现盐霉素可以促进这2种细胞凋亡。MOLT－4细胞表达野生型p53基因，Jurkat细胞中由于基因突变而不表达p53基因，由于许多抗癌药物的诱导凋亡作用均依赖p53基因，可以看出盐霉素可以克服由于p53基因突变而引起的凋亡抵抗作用。然后又将盐霉素作用于26S蛋白酶体过度表达的淋巴癌 （Namalwa Burkitt细胞），其促进了 Namalwa Burkitt细胞的凋亡，而26S蛋白酶体的过度表达可以使细胞出现凋亡抵抗和恶性增殖。说明盐霉素可以克服26S过度表达引起的凋亡抵抗。最后，将盐霉素作用于过度表达P－糖蛋白的人子宫肉瘤细胞 （MES－SA／Dx5），结果同样促进了MES－SA／Dx5细胞的凋亡，而P－糖蛋白是由癌多耐药性基因MDR1编码的一种跨膜糖蛋白［32］，表明盐霉素能够克服P－糖蛋白表达引起的凋亡抵抗。因此，盐霉素可能在急性和慢性淋巴细胞白血病治疗中发挥作用。

2.11 盐霉素与骨肉瘤 Tang等［33］在对盐霉素和骨肉瘤干细胞进行的体外及体内实验中，首先利用无血清培养基干细胞成球的特性从骨肉瘤细胞株U2OS、MG63和SAOS2中分理出间充质干细胞 （MSCs），并用传统的化疗药物甲氨蝶呤 （MTX）作用于 MSCs，结果显示 MSCs仍然可以成球，提示骨肉瘤细胞中存在的耐甲氨蝶呤的MSCs可以促使肿瘤复发；然后研究者利用盐霉素作用于MSCs及正常骨髓干细胞，通过成瘤实验及MTT比色法检测细胞活性，结果显示：盐霉素能够抑制MSCs的成球率并能降低MSCs活性，而正常骨髓干细胞活性则不受抑制；再采用盐霉素与MTX联合用药，结果显示：盐霉素能够增加MSCs对MTX的敏感性。最后研究者利用裸鼠构建骨肉瘤动物模型并分为对照组、盐霉素作用组和多柔比星 （ADM）作用组，结果显示：盐霉素作用组裸鼠肿瘤生长明显受抑制，且从裸鼠骨肉瘤分离出的TSCs成瘤能力明显下降；表明盐霉素能够在体内抑制骨肉瘤干细胞的生长。同时利用免疫组织化学法对裸鼠骨肉瘤细胞中β－catenin和cyclin D1进行染色，发现2种蛋白表达均减少；利用蛋白印迹实验检测GSK3β，结果显示GSK3β活性降低，从而导致β－catenin的分解，提示盐霉素在体内是通过作用于 Wnt／β－catenin途径以实现对肿瘤细胞的抑制作用。Tang等［33］的实验结果表明：盐霉素能够选择性地作用于骨肉瘤干细胞，且这种抑制作用与Wnt／β－catenin关系密切，同时又不影响正常骨髓干细胞的活性，这为临床骨肉瘤治疗提供了一个重要线索。

3 结语与展望

近年来的研究［4，9－16，33］表明：癌的复发及耐药性与癌中存在癌干细胞有密切关系，通过杀伤癌干细胞以达到治疗效果成为近些年来的研究热点与趋势。通过盐霉素与多种不同组织来源的癌细胞及癌干细胞作用的研究表明：盐霉素可能通过多种途径作用于癌细胞及癌干细胞，盐霉素有望作为一种新的有效靶向抗癌药物。

目前已有盐霉素中毒的相关报道，由于盐霉素的生物学活性会使细胞内钾离子聚集而继发引起钙离子的增多，而中毒水平的钙则可激活磷脂酶和蛋白水解酶，从而导致骨骼肌和心肌细胞的损害，严重者可导致横纹肌溶解、急性肾衰、急性心力衰竭、代谢性酸中毒及肺水肿［34－35］。所以盐霉素对人体的相关毒副作用需要进一步研究与克服。尽管目前盐霉素对癌细胞的杀伤作用机制尚未完全明确，但并不影响其引领抗癌研究新方向的作用。

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