自体脂肪间充质干细胞治疗放射性肺损伤的应用前景及研究进展

蒋鑫萍，姜 新，王 瑜，曲雅勤，刘拥军

（吉林大学第一医院肿瘤放疗科，吉林 长春 130021）

放射性肺损伤 （radiation－induced lung injury，RILI）是胸部肿瘤接受放射治疗时不可避免的主要并发症之一。所有接受胸部放疗的患者中，5%～10%会出现不同程度的肺损伤。RILI主要包括早期间质性肺炎和晚期肺纤维化；若纤维化一旦形成，便不可逆转，导致呼吸衰竭危及生命［1］。目前对RILI的治疗仅限于应用糖皮质激素、抗生素及免疫抑制剂等，暂时缓解症状，临床上仍缺乏治疗该病的有效方法。干细胞移植是治疗人体各种疾病最有前景的手段之一。早在2001年，Zuk等［2］首次从脂肪组织中成功分离出干细胞，即脂肪间充质干细胞 （adipose－derived mesenchymal stem cells，AD－MSCs），其是具有多向分化潜能的多能干细胞，来源充足、取材方便，且对机体创伤性小；抗炎性及免疫调节能力更强；可行自体移植治疗且无道德伦理争议等，AD－MSCs已经成为干细胞领域的研究新热点，在医学领域中呈现出广阔应用前景。AD－MSCs凭借自身多种优势广泛应用于各种临床损伤修复和免疫系统疾病的治疗［3］，但目前未见有关AD－MSCs治疗RILI的研究报道，因此本文作者从国内外关注的热点着手，对干细胞修复肺损伤的相关研究进行回顾，并对自体AD－MSCs治疗RILI的应用前景及研究进展做一综述展望，为临床治疗RILI提供一个有效安全的新疗法。

1 RILI发病机制

RILI的病理改变是一个组织损伤及损伤后的修复过程，从损伤应激性炎症反应演变到肺组织结构的修复重建。目前研究［4－5］认为：RILI的发生发展是由多种细胞参与和多种细胞因子共同调控的复杂过程。电离辐射诱导组织细胞产生大量活性氧物质 （reactive oxygen species，ROS）作用于肺泡巨噬细胞、血管内皮细胞、肺泡上皮细胞及成纤维细胞等，使其分泌大量炎性细胞因子、趋化因子和促纤维化生长因子，最终形成一个动态的细胞因子级联瀑布效应。与RILI发生相关的细胞因子主要可以分成两大类：一类是参与局部损伤炎症因子，如肿瘤坏死因子α（TNF－α）、白细胞介素1（IL－1）和干扰素γ（IFN－γ）等；另一类是参与器官组织修复的纤维化因子，如转化生长因子β1（TGF－β1）、表皮生长因子 （EGF）和血管内皮生长因子（VEGF）等。国内外研究［6－7］证实：TGF－β1与放射性肺纤维化发生和形成关系最密切，可以作为RILI的危险预测因子，被普遍认为是RILI发生的主要机制之一。TGF－β1可抑制细胞生长，有抗炎及保持细胞外基质 （ECM）稳定的作用。在放射线导致肺损伤过程中，成纤维细胞、肺巨噬细胞及肺泡上皮细胞被认为是TGF－β1作用的主要靶点。TGF－β1作为一种强有力的促成纤维细胞分裂因子，可促进成纤维细胞的分裂增殖及其成熟分化，促进胶原蛋白、黏蛋白等ECM成分的基因转录及蛋白合成，同时通过抑制蛋白酶的合成来阻止基质蛋白的降解。TGF－β1也是一种重要的化学趋化因子，可趋化肺泡巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞参与炎性反应。TGF－β1还可通过Smad信号通路诱导肺上皮细胞发生间质转化 （EMT），加速肺纤维化［8］。RILI不是单一因素导致的疾病，而是以射线损伤为诱导因素，多种细胞及因子共同参与、相互作用和综合调控的复杂过程。

2 间充质干细胞 （MSCs）修复肺损伤机制

干细胞主要通过调节炎症反应和修复损伤的肺上皮细胞和血管内皮细胞发挥作用，可概括为两方面：抗炎、免疫调节作用和损伤修复作用。

2.1 抗炎和免疫调控作用 干细胞移植能够调节肺部及全身的免疫炎症反应，MSCs可通过直接或间接接触的方式抑制树突细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞的活化，减少促炎因子TNF－α和IFN－γ的释放，增加抗炎因子白细胞介素 （IL－10、IL－4）的分泌［9］。Gupta等［10］在脂多糖 （LPS）诱导的急性肺损伤模型中证实：MSCs移植可下调肺泡及血浆中的促炎因子TNF－α和巨噬细胞炎性蛋白－2 （MIP－2）水平，增加抗炎因子IL－10水平，且IL－13和IL－1受体拮抗剂 （IL－Ira）也有所上升，从而调节促炎与抗炎的平衡。另外，Li等［11］在博莱霉素诱导的肺损伤模型研究中发现：小鼠肺组织中IL－2、IL－4和IFN－γmRNA表达减少，炎症反应程度降低。Rojas等［12］研究还证实：MSCs能分泌前列腺激素2和IL－10等因子，调节血液中巨噬细胞的数量，减轻肺水肿及肺部感染，并能减少血浆中促炎因子的水平，从而降低败血症小鼠的死亡率。MSCs分泌大量促血管新生细胞因子，如肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）和VEGF等，增加肺组织血管及腺泡的生成和修复，从而改善肺组织的血流灌注和换气功能［13－14］。研究［15］显示：在高流量吸氧造成新生小鼠肺损伤模型中，移植MSCs后能旁分泌血管生成素1，从而发挥恢复血管内皮通透性，减轻肺部损伤及肺水肿的作用。有研究利用MSCs分泌活性细胞因子来抑制细胞凋亡，刘红梅等［16］发现：MSCs移植后抑制肺气肿肺泡壁细胞凋亡，同时肺组织中Bcl－2表达增加，Bax蛋白表达减少。研究［16］显示：移植的MSCs可能通过分泌活性细胞因子，上调Bcl－2，下调Bax表达，进而抑制细胞凋亡。抑制凋亡的机制可能通过调整细胞凋亡基因表达，分泌抗凋亡和促进增殖分化细胞因子，加强细胞修复和促进增殖实现。因此，MSCs移植在肺损伤动物模型中具有抗炎作用和免疫调节功能，多种活性细胞因子可通过旁分泌与自分泌作用，促使肺组织血管再生和内皮细胞重塑。

2.2 分化修复作用 MSCs通过趋化作用到达肺损伤部位，可直接或间接分化为原有细胞替代损伤细胞。MSCs有向损伤组织归巢的特性，损伤作为MSCs激活剂，使MSCs向损伤部位迁移而发挥修复作用［17－18］。受损部位的肺组织释放一系列趋化细胞因子，如基质细胞衍生因子1（SDF－1）和血小板衍生生长因子等，这些细胞因子与损伤部位表达的特异性受体相结合，使细胞发生迁移并黏附于受损部位。已有研究［19］证实：MSCs在肺损伤状态下向肺部移行并表现出肺上皮细胞的表型。Ortiz等［20］在博莱霉素诱导的肺损伤模型实验中，采用RT－PCR定量检测发现：外源性的MSCs在肺损伤部位数量与对照组相比增加23倍。MSCs可以补充肺内干细胞池，产生肺组织的分化细胞而修复肺组织损伤。Wang等［21］报道：小鼠肺组织来源 MSCs在体外能够被诱导分化为表达表面活性蛋白C的肺泡Ⅱ型上皮样细胞。Rojas等［12］在研究博来霉素诱导的小鼠肺损伤模型中发现：损伤肺分泌的可溶性因子能引起骨髓间充质干细胞 （BMSCs）数量增加，并向损伤肺组织迁移，替代损伤的肺细胞。由此可见：MSCs有显著向受损部位归巢作用，外源性的MSCs在受损肺组织内可分化为肺上皮细胞、肺间质细胞及肺血管内皮细胞等。

3 AD－MSCs生物学特性及临床应用优势

AD－MSCs是一群具有多向分化潜能的多能干细胞。AD－MSCs完全满足国际干细胞和组织干细胞协会提出人类MSCs定义［22］：① 在标准的培养条件下可以贴附塑料制品的瓶壁生长；② 有多向分化的潜能，可以向成脂细胞和成骨细胞等方向分化；③ 表达CD105、CD73和CD90；④ 不表达造血细胞的标记，如CD45、CD14、CD34和CD19等，也不表达人类白细胞抗原HLA－DR。AD－MSCs不仅能够向成脂细胞、成骨细胞、成软骨细胞和成肌细胞分化，还可向骨骼肌细胞、心肌细胞、神经细胞、胰岛细胞及肝细胞等分化，可用于组织器官修复与替代［23］；AD－MSCs可促进血管新生，改善局部组织缺血，可用于治疗急性心肌梗死、缺血性心肌病、缺血性脑病和肾小管坏死等缺血性疾病；AD－MSCs还具有抗炎及免疫调节特性，用于移植物抗宿主病、风湿性关节炎、炎性肠病和肝纤维化等治疗［24－25］。近年来，已有研究［21］显示：干细胞对RILI模型有良好修复作用，而AD－MSCs作为干细胞家族中最理想的种子细胞，对RILI治疗有着广阔的应用前景。

有关BMSCs、AD－MSCs和脐带血 MSCs的比较研究［26］显 示： 脂 肪 干 细 胞 （adipose－derived stem cells，ADSCs）在形态、免疫表型、分离的成功率、克隆频率以及分化能力方面无区别，AD－MSCs具有与BMSCs相同的免疫抑制特性及分化潜能，且AD－MSCs在培养过程中的克隆频率和增殖能力优于BMSCs。然而AD－MSCs与骨髓脐带等其他干细胞相比还具有以下显著优势：① 取材容易，损伤较小，减轻患者痛苦且避免引起道德争论；② 从患者本身来源的细胞进行自体移植，可以克服免疫排斥情况；③ 体外增殖速度块，不必进行永生化处理即可获得足量的细胞来源用于移植；④ 在体外适当条件可导入外源基因，作为基因治疗的目的基因载体。

目前应用临床治疗的干细胞多来源于成体，临床推广限制相对较小。脐带血源性干细胞的数量有限，同时获得两份或以上相同基因的脐带血源性干细胞十分困难；骨髓源性干细胞的数量相对可观，但提取过程受到一定限制，且会对患者或捐献者带来伤害和痛苦；外周血源性干细胞的提取需要注射动员药物，这可能引起全身的不良反应，而且获取的细胞数量也有限。胚胎干细胞受到伦理原则的严格限制，在临床推广极为困难；诱导性多功能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS）目前处于起始阶段，临床推广应用还不具有可行性。但ADSCs获取相对容易，可以从人的腹部等部位获取大量相同基因的干细胞，对患者的不良伤害极少。而且ADSCs免疫原性弱，减少了异体移植后的不良反应，临床的开展和推广价值极大，前景广阔。

4 MSCs治疗肺损伤的研究现状及存在问题

关于MSCs修复肺损伤的研究多数集中在基础性实验阶段，且肺损伤模型主要集中在博莱霉素、脂多糖、内毒素及射线等诱导的动物模型［27］。研究［20－21，28－31］表明：MSCs在肺损伤修复过程中发挥重要作用，2003年Ortiz等［20］首次发现尾静脉注射BMSCs能明显减轻博来霉素诱导的特发性肺纤维化损伤。2007年Mei等［28］研究发现：MSCs可减轻内毒素诱导的急性肺损伤。随后，2009年Moodley等［29］实验研究发现：脐带MSCs对博莱霉素引起的小鼠肺损伤有治疗作用。同年，Kursova等［30］发现：应用自体BMSCs可降低RILI模型C57／6L小鼠的死亡率，且临床试验显示：自体BMSCs移植延缓胸部放疗致11例放射性肺纤维化患者肺损伤加重的进程，且长期随访并未发现MSCs造成潜在肿瘤的发展。2011年刘伟等［31］研究发现：肺内MSCs可减轻放射诱导的急性肺炎。2013年 Wang等［21］通过 HGF基因修饰BMSCs可明显降低射线引起的小鼠肺纤维化。这些研究结果提示：MSCs在治疗肺损伤中有着良好的修复效果，并为临床应用MSCs移植治疗肺损伤奠定基础。

在MSCs治疗肺损伤研究［32］中还发现：MSCs移植途径、移植时间、移植数量及移植次数等治疗方案的选择可影响治疗肺损伤的效果。研究［20－21］表明：在急性肺损伤后静脉途径给药是较气管内给药更好的给药方式。肺损伤过程中还存在其他气管的损伤，经静脉全身给药不仅可以使MSCs到达损伤的肺部使肺组织得到修复，还能进入其他的损伤器官及继发性的损伤气管，使其得到修复。给药时间选择也是影响肺损伤治疗效果的重要因素之一，Ortiz等［21］研究发现：BMSCs在肺损伤早期迁移进入，可以明显减轻肺纤维化；而MSCs在中期和晚期植入后则参与到纤维化进程。肺受照射4h后输注MSCs会有明显的上皮细胞或血管内皮细胞植入，随后时间输入会使移植的MSCs作为间质细胞参与纤维化的形成。研究［33－35］表明：BMSCs可以定植于损伤的肺组织，并能有效阻止博来霉素诱导的大鼠肺纤维化，早期治疗效果优于晚期。MSCs在小鼠肺组织受到损伤后立即植入体内可以向各种肺功能细胞分化，然而这种干细胞的分化趋向的巨大差异可能受到以TGF－β为首的细胞因子等体内微环境的影响和引导。这提示博来霉素或反射诱导急性肺损伤的早期是MSCs治疗的特异窗口期。另外，机体的免疫状态对MSCs的植入也可能存在影响。Rojas等［12］发现：经白消安诱导免疫抑制的博来霉素肺损伤模型组的肺组织比无免疫抑制对照组所含骨髓数量明显增多。认为可能是免疫抑制减少了内源性循环干细胞，从而使更多的外源性干细胞转化以修复组织，提示内源性循环干细胞可能向损伤肺组织聚集参与修复。

5 结 语

目前MSCs治疗肺损伤在动物模型研究中已经取得可喜进展，MSCs以自身强大生物学功能来改善肺损伤。AD－MSCs凭借自身优势，即方便用于自体移植，解决移植排斥反应和道德伦理问题，从根本上解决安全性问题。现阶段MSCs治疗肺损伤研究大多基于动物模型，能否真实反映人体内环境还是未知，随着研究的不断深入，相信问题总会得到解决。总之，自体AD－MSCs移植在治疗RILI方面定会有潜在广阔临床应用前景。

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