参松养心胶囊对心梗后心肌的保护作用及机制研究

刘自强，王 晞，党 松

(武汉大学人民医院心内科，湖北 武汉 430060)

参松养心胶囊对心梗后心肌的保护作用及机制研究

刘自强，王 晞，党 松

(武汉大学人民医院心内科，湖北 武汉 430060)

目的 探讨参松养心胶囊(SSYX)对心肌梗死后心律失常发生和心功能不全的影响及其作用机制。方法将40只新西兰大耳白兔行冠状动脉前降支结扎术后随机分为正常对照组(Control组)10只、心梗组(MI组)10只、心梗+胺碘酮组(MI+A组，0.4 g·kg-1·d-1)10只、心梗+参松组(MI+S组，0.5 g·kg-1·d-1)10只。正常对照组开胸后在冠状动脉下穿线，但不结扎。术后，分别以普食、普食+胺碘酮粉末、普食+参松养心胶囊原粉喂食。8周后将家兔处死，在心梗周边区取材，检测各组白兔缝隙连接蛋白43(CX43)、钠钙交换体(NCX)和兰尼碱受体蛋白(RyR2)mRNA的相对表达量。结果与Control组比较，MI组CX43、RyR2 mRNA相对表达量显著下降(P＜0.05)，而NCX mRNA相对表达量虽然有所下降，但其差异无统计学意义(P＞0.05)；与MI组比较，MI+A组CX43、RyR2 mRNA相对表达量显著升高(P＜0.05)，MI+S组CX43、NCX、RyR2 mRNA的相对表达量也显著升高(P＜0.05)；与MI+A组比较，MI+S组CX43、NCX mRNA的相对表达量均显著升高(P＜0.05)。结论参松养心胶囊可以改善心肌梗死后心律失常以及心功能不全，其机制可能与调控各钙离子通道的开放，抑制钙超载有关。

参松养心胶囊；心肌梗死；钙通道；缝隙连接蛋白43；钠钙交换体；兰尼碱受体蛋白

心肌梗死是在冠脉病变的基础上发生冠脉血供急剧减少或中断，使相应心肌严重而持久地急性缺血，导致心肌坏死。75%～95%的患者伴有心律失常，严重者甚至发生室颤，导致猝死。现在临床上常用的许多抗心律失常西药虽然能控制心律失常的发生，改善心律失常的症状，但是往往导致病死率以及死亡率的升高[1]，因此，如何在控制心律失常的同时又减少病死率，改善患者的预后，成为临床上治疗心律失常的一个难题。参松养心胶囊由五味子、麦冬、丹参、黄连等多种中药组成的复方剂，在体动物模型已证实，参松养心胶囊可以通过抑制多种离子通道来预防因化学毒物或缺血再灌注引起的心律失常，并且可以通过调控各种离子通道蛋白来改善心功能，减少病死率及死亡率，并且不会出现致心律失常的副作用[2-3]，但是具体是哪些离子通道影响的且作用机制如何，尚未可知。目前研究表明钙离子通道可能在预防心梗后的心律失常中发挥了重要作用，为此，笔者通过建立心梗模型研究参松养心胶囊对缝隙连接蛋白43(CX43)、钠钙交换体(NCX)、兰尼碱受体蛋白(RyR2) mRNA水平的影响并探讨这些离子通道改善心律失常的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 新西兰大耳白兔(武汉生物研究所提供，体重2.2～2.5 kg)；离心机(Heal Force)型号：台式高速冷冻离心机Neofuge 15R；PCR仪(Hangzhou Bioer Teechnology Co，LTD)型号：Life express Thermal Cycler；SLAN荧光定量PCR检测系统(上海宏石医疗科技有限公司)；超净工作台(苏净安泰)型号：SW-CJ-1FD；Trizol Reagent(Invitrogen Life Technologies)目录号：15596-026；ReverTra Ace-α-目录号：K-1622；TOYOBO THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix目录号：QPS-201；离心管、TIP头(Axygen Biosciences)；青霉素(华北制药股份有限公司生产)、三氯甲烷国药集团(化学试剂有限公司)、异丙醇(国药集团化学试剂有限公司)、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)；参松养心原粉(石家庄以岭药业股份有限公司)；引物(Invitrogen Biotechnology Co，LTD)。

1.2 动物模型的制作及分组 取40只新西兰大耳白兔，随机分为正常对照(Control)组、MI组、MI+A组及MI+S组，每组10只。动物称重后以戊巴比妥(40 mg/kg)耳缘静脉麻醉，并经前胸暴露心脏，结扎冠状动脉左前降支。以心电监护显示Ⅰ、Ⅱ、aVL导联ST段抬高0.2 mV为手术成功的标准，术后注射40万U青霉素。分别以普食(Control组、MI组)、普食+胺碘酮粉(MI+A组，胺碘酮粉剂量0.4 g·kg-1·d-1)及普食+参松养心原粉(MI+S组，参松养心原粉剂量0.5 g·kg-1·d-1)喂养8周。

1.3 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)

1.3.1 总RNA的提取 取100 mg左室心肌梗死周边区组织置匀浆器中，加入1 ml的Trizol，冰上匀浆，使核蛋白充分解离；并经氯仿分离，异丙醇沉淀，乙醇洗涤后，离心，弃上清，最终加入双蒸水溶解，并用紫外分光光度法分析RNA的纯度与浓度。

1.3.2 反转录 根据总RNA的含量，以其中的mRNA为模板，利用逆转录酶反转录合成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增。

1.3.3 实时荧光定量PCR 按照合成说明，在引物中加入ddH2O，制成2.5 μmol/L溶液，引物序列见附表1。在cDNA中加入相关引物，并按照RT-PCR试剂盒(TOYOBO)说明，以95℃预变性1 min后进入PCR循环，95℃变性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，循环40次。反应完成后计算机自动计算CT值，CT值定义为：每个反映管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环次数，即从基线到指数增长所经历的循环次数。

表1 各目的基因及引物的相关信息表

1.4 统计学方法 应用SPSS21统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

心梗模型制备过程中，3只新西兰大耳白兔由于意外情况出现猝死(2只死于室颤，1只原因未明)，剩余37只(Control组10只，MI组9只，MI+A组9只，MI+S组9只)均制备心梗模型成功，且顺利完成各指标的检测。检测结果如下：与Control组比较，MI组CX43、RYR2 mRNA相对表达量显著下降(P＜0.05)，而NCX mRNA相对表达量虽然有所下降，但其差异无统计学意义(P＞0.05)。与MI组比较，MI+A组CX43、RYR2 mRNA相对表达量显著升高(P＜0.05)， NCX mRNA的相对表达量也有所升高，但其差异无统计学意义(P＞0.05)；MI+S组CX43、NCX、RYR2 mRNA的相对表达量皆显著升高(P＜0.05)。与MI+A组比较，MI+S组CX43、NCX mRNA的相对表达量显著升高(P＜0.05)，RYR2 mRNA的相对表达量也有所升高，但其差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 药物干预8周后CX43、NCX、RYR2、mRNA的表达(±s)

表2 药物干预8周后CX43、NCX、RYR2、mRNA的表达(±s)

注：与Control组比较，aP＜0.05；与MI组比较，bP＜0.05；与MI+A组比较，cP＜0.05。

组别Control组MI组MI+A组MI+S组只数10 9 9 9 CX43 2.4090±0.3643 2.0419±0.1485a2.1508±0.1796b2.4914±0.0971bcNCX 2.6311±0.5136 2.2698±0.1781 2.4448±0.0949 2.8254±0.1526bcRYR2 2.5670±0.5124 2.1587±0.1846a2.5403±0.1462b2.7542±0.1334b

3 讨 论

心梗后心律失常是心源性死亡的主要原因之一，而钙超载是心梗后心律失常发生和维持的重要原因。钙超载可以使心肌部分去极化，缩短动作电位时程，诱发短暂后除极，引起缺血性心律失常，而且Ca2+电流任何微小的变化即可导致其他离子电流改变，造成心肌电活动异常，抑制钙超载可以明显减小心梗后心律失常的发生率[4-5]，CX43、NCX、RYR2 mRNA可编码钙循环相关的通道蛋白，调控细胞内外钙离子的转运，钙离子转运的异常是钙超载发生的主要病理生理机制，故CX43、NCX、RYR2 mRNA的表达水平可以一定程度反应钙超载的状态。参松养心胶囊是近年来新发现的中成药，可以明显减弱心梗后心律失常的发生，并改善心功能[3，6]，究其机制仍不明确，而本文发现，参松养心胶囊可明显增加CX43、NCX、RYR2mRNA的表达水平，提示参松养心胶囊的心肌保护作用可能与抑制钙超载有关。

Cx43是缝隙连接蛋白，主要存在于心房和心室中，参与心肌细胞间信号传导。有研究发现，心肌梗死CX43蛋白表达减少或降解增多，导致缝隙连接减少，电传导减慢，异向性增加，动作电位离散幅度增加，且心梗后Cx43蛋白各部位重排程度不一，心肌电冲动经过这些部位时传导速度会出现不均一性增高，这些都是形成折返和传导阻滞的基础，进一步诱发心律失常[4，7]。此外，Cx43蛋白的磷酸化、去磷酸化以及分布均可影响缝隙连接的导电性，诱发心律失常[8]。研究显示，心肌缺血可导致Cx43脱磷酸化，缝隙连接通道的开放，进而Ca2+内流增加，引起钙超载，加重心律失常和心肌细胞坏死[10]。同时有研究证实，Cx43可以通过调节活性氧(ROS)生成，稳定线粒体膜，抑制钙超载，减轻缺血心肌细胞的凋亡和坏死，改善心功能[11-12]。本研究发现，参松养心胶囊可上调CX43表达，抑制钙超载发生，进而抑制心律失常保护心肌。

NCX是维持细胞内Ca2+浓度稳定的主要通路之一正常生理状态下，NCX主要在心肌细胞复极化后期，介导前向模式，与钙泵一起，将胞质内的钙离子转运到细胞外或肌质网内，从而降低胞浆内Ca2+浓度，促使细胞舒张[13-14]；膜去极化或胞质中Na+浓度较高时，NCX可以介导反向模式，调节细胞的生理功能[15]。而在缺血、缺氧等病理条件[16]下NCX也能够介导反向模式的Ca2+内流，引起胞内钙超载，诱发细胞凋亡与坏死[17]。本研究发现，与MI组比较，参松养心胶囊可明显增加心梗周边区NCX mRNA水平，胺碘酮组也表现了增高趋势但未达统计学意义，故笔者推测参松养心胶囊可能是介导了NCX的前向模式抑制了钙超载，从而抑制心律失常发生保护心功能，但其机制及正确性仍需进一步研究证实。

RYR2是心肌肌浆网中的钙释放通道，其表达下调和功能异常造成的Ca2+渗漏是许多心律失常疾病以及心力衰竭疾病的发病基础。生理状态下，FKBP12.6与RyR2相结合，阻止Ca2+通道的开放，减少钙渗漏。心梗后钙渗漏增多，可能与高肾上腺素水平激活PKA，RyR2被过度磷酸化，导致FKBP12.6解离，舒张期通道开放频率增加，肌浆网中Ca2+泄漏增多[18]，进而引起延迟后除极(DAD)有关，而FKBP12.6缺失小鼠的心房肌细胞中Ca2+的泄漏及房颤发生的倾向性增加则支持该观点[19]。也可能与CaMKⅡ被激活及RyR2 Ser2815磷酸化增多有关，而RyR2-S2814A基因工程小鼠对房颤的保护作用也支持该观点[21]。心梗患者RYR2 mRNA的表达量降低，RYR2功能抑制和数量减少使肌浆网钙释放不足，心肌收缩力下降[6]，同时，Ca2+泄露使肌浆网中钙储存下降，不能释放足够的Ca2+，心脏收缩功能下降。研究表明，参松养心胶囊可以提高RYR2的表达水平，减少钙渗漏，抑制钙超载，从而减少心律失常的发生和改善心功能。

综上所述，参松养心胶囊对各钙离子通道的综合作用是抑制钙超载，降低心肌细胞的除极幅度，延长动作电位时程和有效不应期，这可能是其抗心律失常作用的主要机制之一。同时减轻钙超载对心肌细胞的损害，增强心肌收缩力，从而改善了心功能。简言之，参松养心胶囊可以抑制钙超载，对抗心律失常，增强心肌收缩力，起到保护心肌的作用。

[1]Preliminary report:effect of encainde and flecainide on mortality in a randomized trial of arrhythmic suppression after myocardial infartion [J].N Engl J Med,1989,321(6):406-412.

[2]蒋小波,黄从新,黄 鹤,等.参松养心胶囊对兔心肌梗死后神经重构的影响[J].中国心脏起搏与心电生理杂志2014,28(1):59-62.

[3]柴松波,王硕仁,姚立芳,等.参松养心胶囊对大鼠心梗后心室重构及其离体心脏动作电位影响的研究[J].北京中医药,2009,28 (12):967-971.

[4]秦联萍.细胞内钙一缝隙连接因子在针刺预治疗改善缺血性心律失常中的作用[D].北京:中国中医科学院,2005.

[5]安瑞海,傅绍萱,李蕴山.钙离子,钙拮抗剂与缺血性心律失常[J].生理科学进展,1989,20(3):219-223.

[6]姜 浩,农一兵,林 谦,等.益气活血药对心梗后心功能不全大鼠心肌细胞RYR2、SERCA2a及PLB mRNA表达的影响[J].中华中医药杂志(原中国医药学报),2011,26(9):1957-1960.

[7]梁 庆,林吉进,李玉光.缝隙连接、蛋白43及其与心律失常的关系[J].中国心血管杂志,2006,11(1):59-62.

[8]窦光华,何维来.Cx43连接蛋白与心脏发育[J].心脏杂志,2011, 23(2):260-262.

[9]Miura T,Ohnuma Y,Kuno A,et al.Protective of gap junctions in preconditioning against myocardial infarction[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2004,286(1):H214-221.

[10]季 永,张可璇,毛洪雅,等.缝隙连接蛋白Cx43介导硫化氢后处理对大鼠心肌的保护作用[J].中国药理学通报,2013,29(7):999-1003.

[11]Forbes RA,Steenbergen C,Murphy E.Diazoxide-induced cardioprotection requires signaling through a redox-sensitivem mechanism[J].Circ Res,2001,88(8):802-809．

[12]Aronsen JM,Swift F,Sejersted OM.Cardiac sodium transport and excitation-contraction coupling[J].J Mol Cell Cardiol,2013,61:11-19.

[13]Ottolia M,Torres N,Bridge JH,et al.Na/Ca exchange and contraction of the heart[J].J Mol Cell Cardiol,2013,61:28-33.

[14]Roome CJ,Power EM,Empson RM.Transient reversal of the sodium/calcium exchanger boosts presynaptic calcium and synaptic transmission at a cerebellar synapse[J].J Neurophysiol,2013,109 (6):1669-1680.

[15]Cuomo O,Gala R,Pignataro G,et al.A critical role for the potassium-dependent sodium-calcium exchanger NCKX2 in protection against focal ischemic brain damage[J].J Neurosci,2008,28(9): 2053-2063.

[16]Kitao T,Takuma K,Kawasaki T,et al.The Na+/Ca2+exchangermediated Ca2+influx triggers nitric oxide-induced cytotoxicity in cultured astrocytes[J].Neurochem Int,2010,57(1):58-66

[17]Neef S,Dybkova N,Sossalla S,et al.CaMKII-dependent diastolic SR Ca2+leak and elevated diastolic Ca2+levels in right atrial myocardium of patients with atrial fibrillation[J].Circ Res,2010,106(6): 1134-1144．

[18]Chelu MG,Sarma S,Sood S,et al.Calmodulin kinase II-mediated sarcoplasmic reticulum Ca2+leak promotes atrial fibrillation in mice [J].J Clin Invest,2009,119(7):1940-1951.

[19]Neef S,Dybkova N,Sossalla S,et al.CaMKII-dependent diastolic SR Ca2+leak and elevated diastolic Ca2+levels in right atrial myocardium of patients with atrial fibrillation[J].Circ Res,2010,106 (6):1134-1144.

Myocardial protective effects of shensongyangxin capsule after myocardial infarction and the possible mechanisms.

LIU Zi-qiang,WANG Xi,DANG Song.Department of Cardiology,Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo explore the effect of shensongyangxin capsule(SSYX)on arrhythmia and cardiac insufficiency after myocardial infarction(MI)in rabbits.MethodsForty New Zealand White rabbits were randomly assigned into control group,MI group,MI+amiodarone group(MI+A group,with the dose of amiodarone at 0.4 g·kg-1·d-1)and MI+SSYX group(MI+S group,with the dose of SSYX at 0.5 g·kg-1·d-1)after successful establishment of model of MI,each with 10 rabbits.The control group applied stitches at coronary artery without ligation.The other three groups applied routine food,routine food+amiodarone,routine food+SSYX after surgery,respectively.After eight weeks,ryanodine receptor 2(RyR2),Connexin43(CX43),sodium-calcium exchanger(NCX)mRNA expression in peri-infarcted area were examined.ResultsCompared with control group,CX43,RyR2 mRNA relative expression significantly decreased in MI group(P＜0.05),but NCX mRNA relative expression showed slight decrease without statistically significant difference(P＞0.05).Compared with MI group,CX43,RyR2 mRNA relative expression significantly increased in MI+Agroup(bothP＜0.05),and CX43,NCX,RyR2 mRNArelative expression significantly increased in MI+ S group(allP＜0.05).Compared with MI+A group,CX43,NCX,mRNA relative expression significantly increased in MI+S group(allP＜0.05).ConclusionSSYX can improve arrhythmia and cardiac dysfunction after myocardial infarction,which may be related to the open of calcium ion channels and the inhibition of calcium overload.

Shensongyangxin(SSYX);Myocardial infarction(MI);Calcium ion channel;Connexin43 (CX43);Sodium-calcium exchanger(NCX);Ryanodine receptor 2(RyR2)

R542.2+2

A

1003—6350（2015）24—3589—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.24.1299

2015-04-23)

国家重点基础研究发展计划(973计划)(编号：2012CB518604)

王 晞。E-mail：xiwangwhu@163.com