年龄和性别对健康人群外周血I型干扰素基因表达的影响

牛志立，张平安，童永清

(武汉大学人民医院检验科，湖北 武汉 430060)

年龄和性别对健康人群外周血I型干扰素基因表达的影响

牛志立，张平安，童永清

(武汉大学人民医院检验科，湖北 武汉 430060)

目的 观察不同性别和年龄健康人外周血单个核细胞（PBMC）中I型干扰素mRNA表达，探讨I型干扰素基因表达的性别和年龄差异。方法选择113例健康人，中老年54例包括女性27例和男性27例，平均(63±8)岁；青年人59例包括女性30例和男性29例，平均(36±6)岁。取抗凝全血，实时荧光定量PCR检测干扰素α(IFN-α)和干扰素β(IFN-β)的mRNA表达。结果健康中老年男性IFN-α和IFN-β基因表达量与青年男性比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，且前者基因表达量分别比后者低25倍和2.9倍；健康中老年女性IFN-α和IFN-β基因表达量与青年男性比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，且前者基因表达量分别比后者低6.67倍和3.57倍；健康青年男性IFN-α和IFN-β基因表达量与青年女性比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，且前者基因表达量分别比后者低4倍和1.92倍；健康中老年男性IFN-α基因表达量和中老年女性比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，且前者基因表达量比后者低16.67倍，但健康中老年男性IFN-β基因表达量和中老年女性比较，差异无统计学意义(P＜0.05)。结论性别和年龄对I型干扰素表达有一定的影响，为临床研究免疫相关性疾病的发病机制提供理论基础。

健康人群；外周血单个核细胞；I型干扰素；实时荧光定量PCR

性别长期以来被认为与免疫功能有很大关系。最近有研究表明丙肝病毒(HCV)女性感染者有更强的清除能力和持续病毒学应答(Sustained virologic response，SVR)[1-2]。对于病毒感染而言，男性血清IgG、IgM和IgA的基线水平相对于女性显著减少[3]。此外，对于获得感染性疾病的男性比女性具有较高的TNF-α(Tumor necrosis factor)，导致男性的疾病更严重，而女性患者的炎症水平比男性高，这意味着女性比男性表现出更强的免疫反应[4-5]。研究HIV(Human immunodeficiency virus)的结果表明，未治疗的女性比男性的生存率要低而且女性比男性具有较低的病毒载量，有趣的是，病毒控制的女性患者在5～7年内病毒载量比男性上升的速度要快的多[6-7]，这说明病毒载量在不同性别是不一致的。

Ⅰ型干扰素包括IFN-α和IFN-β，具有抑制病毒复制、抗寄生虫、抑制多种细胞增殖、刺激免疫细胞的杀伤活性、参与免疫调节、抗肿瘤等作用[8]。病毒感染人体后，可通过Toll受体或其他受体的识别激活I型干扰素，激活的Ⅰ型干扰素基因表达的蛋白激活JAK-STAT信号通路，最终激活干扰素诱导基因(Interferon stimulated gene，ISG)的表达而发挥抗病毒作用[8-9]。目前关于雌激素与Ⅰ型干扰素之间的研究，尤其对女性绝经期和非绝经期的研究国内外较少，本文将从性别和年龄的角度对绝经期和非绝经期的健康人群的女性和年龄匹配的男性进行Ⅰ型干扰素基因表达的研究和比较，观察是否健康女性Ⅰ型干扰素的表达水平比男性具有较高的基础水平，分析是否易感性取决于不同性别人群的干扰素不同，最终为临床研究免疫相关性疾病的发病机制提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年3月至2014年8月在武汉大学人民医院体检的113例健康人，按照世界卫生组织年龄划分标准分为中老年组(年龄＞45岁)和青组(＜45岁)[10]。中老年人包括女性27例和男性27例，年龄51～74岁，平均(63±8)岁，青年人包括女性30例和男性29例，年龄25～43岁，平均(36±6)岁。本研究经我院伦理委员会批准[编号：(2013)鄂伦字(KY-035)]，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 淋巴细胞分离液由天津美德太平洋科技有限公司提供，Trizol和SYBR Premix ExTaqⅡ由TaKaRa公司提供，反转录试剂盒由Thermo SCIENTIFIC公司提供。PCR分析仪由Applied Biosystem Inc公司生产；VII7荧光定量分析仪由ABI公司生产。

1.3 研究方法

1.3.1 引物设计 利用美国国立生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)网站中提供的IFN-α和IFN-βmRNA序列和BLAST进行引物设计，见表1。所有引物均由上海维基生物科技有限公司合成。

表1 基因IFN-α，IFN-β和GAPDH的上下游引物

1.3.2 mRNA提取和逆转录 采集所有研究对象空腹静脉血2ml于EDTA抗凝的采血管中，按照淋巴细胞分裂液说明书(天津美德太平洋科技有限公司)提取2ml外周血单个核细胞(PBMC)并用Trizol法提取PBMC总mRNA。取11 μl RNA模板进行逆转录，加入1µl oligo引物混匀并瞬时离心，65℃5min，反应体系：4µl Reaction Buffer，2 μl Mix，1µl RI，1µlRT。反应条件：42℃60min，72℃10min，4℃保存。得到的cDNA产物放置在-20℃保存备用。

1.3.3 荧光定量PCR检测 反应体系为cDNA1µl，上下游引物各lµl，SYBR Premix ExTaqⅡ10µl，ROXⅡ0.4µl，ddH2O7.6 ul，总体积为20µl。3个基因(IFN-α，IFN-β，GAPDH)扩增反应条件均为94℃30 s预变性，94℃20 s，60℃20 s，72℃35 s，50个循环，溶解曲线条件：95℃15 s，60℃1min，95℃15 s。扩增效率验证：本实验对3个基因(IFN-α、IFN-β、GAPDH)进行了10倍稀释，稀释5个梯度，目的基因和内参基因扩增效率相差小于5%，且在98%～102%之间，可以认为扩增效率近似相等[11]。

1.4 统计学方法 应用SPSS20.0软件对数据进行统计分析，计量资料呈正态分布且方差齐性的资料以均数±标准差(x-±s)表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Ⅰ型干扰素基因mRNA在中老年组和青年组间的表达情况 健康中老年男性IFN-α和IFN-β基因表达量与青年男性比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，并且其基因表达量分别比后者低25倍和2.9倍。健康中老年女性IFN-α和IFN-β基因表达量与青年男性比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，并且其基因表达量分别比后者低6.67倍和3.57倍，见表2。

表2 I型干扰素基因mRNA在中老年组和青年组间的表达情况(±s)

表2 I型干扰素基因mRNA在中老年组和青年组间的表达情况(±s)

注：2-△△Ct表示表达量的倍比关系，△△Ct=△Ct中老年组-△Ct青年组。

组别IFN-β(△Ct)男性 女性IFN-α(△Ct)IFN-β(△Ct)IFN-α(△Ct)中老年组青年组2-△△Ctt值P值9.09±2.107.27±1.3528/1003.940.000115.60±2.9010.87±2.594/1006.430.00019.77±1.238.20±1.2634/1004.720.000111.64±2.408.90±1.3915/1005.340.0001

2.2 Ⅰ型干扰素基因mRNA在女性组和男性组间的表达情况 健康青年男性IFN-α和IFN-β基因表达量与青年女性比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，并且其基因表达量分别比后者低4倍和1.92倍。健康中老年男性IFN-α基因表达量和中老年女性比较差异有统计学意义(P＜0.05)，并且其基因表达量比后者低16.67倍。但是健康中老年男性IFN-β基因表达量和中老年女性比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表3 I型干扰素基因mRNA在女性组和男性组间的表达情况(±s)

表3 I型干扰素基因mRNA在女性组和男性组间的表达情况(±s)

注：2-△△Ct表示表达量的倍比关系，△△Ct=△Ct男性组-△Ct女性组。

组别 青年 中老年IFN-α(△Ct)IFN-β(△Ct)IFN-α(△Ct)IFN-β(△Ct)男性组女性组2-△△Ctt值P值10.89±2.588.90±1.3925/1003.670.0018.20±1.267.27±1.3552/1002.710.00915.60±2.9011.64±2.46/1005.470.00019.77±1.239.09±2.1062/1001.450.15

3 讨论

有研究报道[2，12-13]，不同性别的人感染病毒后对I型干扰素的表达和治疗反应不同，导致病毒的清除能力也不一致，如HCV感染的女性比HCV感染的男性具有较高的病毒自我清除能力，并且对抗病毒治疗的效果也不相同。如果对女性进一步分析发现[12-13]，年轻女性比老年女性获得更高的持续病毒学应答，但是青年男性和老年男性之间并无差别。对HCV感染的老年男性和老年女性研究发现[13]，经过抗病毒治疗的老年男性要比抗病毒治疗的老年女性更易获得持久病毒学应答反应，但是他们都不如绝经前的女性更易获得持久的病毒学应答反应。有研究发现，HIV感染的女性比男性具有较高的IFN-α水平，IFN-α上调CD8+T细胞上的CD38分子，这有利于免疫细胞的激活并且增加女性的死亡率[6-7，14]。

有研究表明[5，15]，女性比男性具有更强的抗病毒感染能力，这与雌激素具有增强免疫功能的作用有很大的关系，并且随着年龄的增长，性激素水平下降，对免疫的调节作用减弱，导致老年人免疫力下降。有研究报道[16-17]，与对照的健康女性相比，TLR7激动剂咪喹莫特(Imiquimod)刺激健康男性的PBMC不会增加IFNα的分泌。本次研究发现，健康青年女性比中老年女性具有较高的IFN-β表达水平，同时比青年男性具有较高的IFN-α和IFN-β基因表达水平。对于男性而言，健康青年男性比中老年男性具有较高的IFN-α和IFN-β基因表达水平。除此之外，本实验发现中老年男性比中老年女性具有较高的IFN-α基因表达水平，但是IFN-β基因表达在两者之间没有差异，这可能与研究对象例数较少等原因有关，其具体机制还需要进一步研究。

最近研究发现[18-19]，雌激素受体与Toll样受体具有协同作用，共同参与病毒的识别和信号传递，雌激素通过经典或非经典途径激活雌激素反应元件，经NF-kB因子的活化最终激活I型干扰素。从本文的研究结果可以看出，青年女性比男性具有更高的Ⅰ型干扰素表达水平，在一定程度上对女性的抗病毒和免疫功能的调节起到很大的作用，这可以为临床上研究免疫相关性疾病的发病机制提供参考。

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Effect of age and gender on the expression of typeⅠinterferon gene in peripheral blood of healthy people.

NIU Zhi-li,ZHANG Ping-an,TONG Yong-qing.Department of Laboratory Science,Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo explore the effects of gender and age on the expression of typeⅠinterferon by investigating the expression of typeⅠinterferon mRNA in peripheral blood mononuclear cells(PBMC)of healthy individuals.MethodsPeripheral blood samples were collected from113 healthy individuals,which consisted of54 middle-and old-aged participants[27 females and27 males,with the mean age of(63±8)years old]and59 young participants[30 females and29 males,with the mean age of(36±6)years old].Expression levels of interferon-α(IFN-α)and interferon-β(IFN-β)mRNA were detected by real-time quantitative PCR.ResultsThe mRNA expression of gene IFN-αand IFN-βwere significantly different between healthy middle-and old-aged males and young males(P＜0.05),and the gene expression of the former was25 and2.9 times lower than the latter,respectively.The mRNA expression of gene IFN-αand IFN-βshowed significant difference between healthy middle-and old-aged females and young females(P＜0.05),and the gene expression of the former was6.67 and3.57 times lower than the latter,respectively.The mRNA expression of gene IFN-αand IFN-βwere significantly different between healthy young males and young females(P＜0.05),and the gene expression of the former was4 and1.92 times lower than the latter,respectively.The mRNA expression of gene IFN-αwas significantly different between healthy males and females of middleand old-age(P＜0.05),and the gene expression of the former was16.67 times lower than the latter.However,the expression of IFN-βgene showed no statistically significant differences between middle-and old-aged males and females(P＜0.05).ConclusionGender and age discrepancies have a relationship with the expression of typeⅠinterferon,which may provide a theoretical basis for the pathogenesis of clinical studies of immune related diseases.

Healthy individuals;Peripheral blood mononuclear cells;TypeⅠinterferon;Real-time quantitative PCR

R446.6

A

1003—6350（2015）16—2400—03

2014-10-17)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.16.0865

张平安。E-mail：zhangpingan@aliyun.com