反硝化细菌固定化降解亚硝酸盐的研究

曹月坤，林晓东，李长波，姚秀清

亚硝酸盐作为生态系统中氮循环的一个自然组成部分，广泛存在于天然水体中。水体中亚硝酸盐是一种潜在危险物，含量过高会对人和动物产生毒害作用，是比较棘手的问题［1-2］。反硝化细菌是一类能利用亚硝酸盐氮等为氮源，有机质为碳源，且能进行自身繁殖的微生物。在反硝化过程中，能将亚硝酸盐转化成氮气从而达到降低水体中有害物质的积累。但直接应用反硝化细菌降解养殖水体中的亚硝酸盐会产生菌浓低、易流失、不容易控制等问题。固定化微生物技术强化生物脱氮过程是近年来研究的焦点。李芳芳等［3］研究了固定化硝化菌和好氧反硝化菌对氨氮废水的处理，氨氮去除率达到90.31%，亚硝酸盐积累仅0.032 mg/L。Lu Yu 等筛选了两株细菌，分别为Stenotrophomonas sp. ZZ15 和Oceanimonas sp. YC13，添加到工业废水处理装置中可以增加硝酸盐的去除率，固定化的ZZ15 和YC13与直接添加相比，去除率的增加幅度相对较低［4］。Christopher B Hill 等对比了硝化菌，以及硝化菌与反硝化菌的混合菌群固定化用于脱除废水中氨氮的研究，结果发现两种固定化细菌体系对氨氮的去除效果相当，不同之处在于固定化的硝化-反硝化菌体系没有硝酸盐积累［5］。郑黎明对国内外包埋法固定化技术生物脱氮的研究进展进行了综述，认为微生物固定化可以弥补传统生物脱氮方法中的不足，达到高效脱氮的目的［6］。但大部分相关研究工作都针对生活或工业废水，对较低亚硝酸盐含量的养殖水体利用固定化反硝化菌处理的研究较少。本文以实验室富集培养的反硝化细菌为研究对象，对其进行了包埋固定化，为固定化反硝化细菌降解亚硝酸盐的应用提供基础。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

海藻酸钠、聚乙烯醇、氯化钠、氯化钙、硝酸钠、亚硝酸钠、磷酸氢二钾、磷酸、甲醇、氢氧化钠、无水氯化钙、硫酸铜、无水乙醇、硫酸锌、硫酸肼、葡萄糖、盐酸、柠檬酸、蔗糖均为分析纯;磺胺、N-1-萘基乙二胺盐酸盐均为化学纯。

W-O 系列恒温油水浴锅;VIS-7220 可见分光光度计;LD5-2A 低速离心机;BT125D 电子天平。

1.2 实验方法

1.2.1 反硝化细菌的富集培养 富集培养基:葡萄糖5 g，硝酸钠1 g，氯化钙0. 67 g，磷酸氢二钾6.7 g，10 L 水。

1.2.2 反硝化细菌菌悬液的制备 将本实验富集培养的反硝化细菌培养液在4 000 r/min 条件下离心10 min，倒掉上清液，沉淀用自来水稀释，制成菌悬液。

1.2.3 固定化反硝化细菌小球的制备 SA 制备的小球:①将SA 用水浸泡24 h，然后加热溶解，冷却至35 ℃;②取适量菌悬液，按照菌悬液与SA 溶液体积比1 ∶2 的比例混合，充分搅匀;③配制5%CaCl2溶液，用注射器将②配制的混合液缓慢滴入，不断搅拌在液体中形成小球;④小球在CaCl2溶液中继续交联4 h;⑤滤出小球，用生理盐水洗涤2 ～3次，备用。

PVA 制备的小球:①将浸泡24 h 的PVA 加热溶解，冷却至35 ℃;②取适量菌悬液，按菌悬液与PVA 溶液体积比1∶2 的比例混合，充分搅匀;③将配制的PVA-菌体混合液缓慢滴入到1% CaCl2溶液中;④小球在CaCl2溶液中继续交联10 h;⑤滤出小球，用生理盐水洗涤2 ～3 次，备用。

PVA+ SA 制备的小球:①将PVA 和SA 浸泡24 h，加热溶解，冷却至35 ℃;②取适量菌悬液，按菌悬液与PVA+SA 混合液(SA 和PVA 体积比1∶1)体积比1∶2 的比例混合，充分搅匀;③将配制的PVA+SA-菌体混合液缓慢滴入到1% CaCl2溶液中;④小球在CaCl2溶液中继续交联10 h;⑤滤出小球，用生理盐水洗涤2 ～3 次，备用。

1.2.4 不同包埋方法对亚硝酸氮去除的影响 配制NO2

－-N 浓度50 mg/L 和葡萄糖浓度140 mg/L的模拟养殖水体。按照1.2.3 节分别制备3 种小球各10 mL，然后分别加入到50 mL 的模拟养殖水体中，在28 ℃条件下处理，每24 h 测定-N 浓度。

1.3 分析方法

2 结果与讨论

2.1 3 种不同固定化方法制备的反硝化细菌小球性质比较

分别以SA、PVA、PVA +SA 的混合物为包埋材料对反硝化细菌进行固定化，制备的3 种小球分别见图1 ～图3。

图1 SA 固定的反硝化细菌小球Fig.1 The balls of denitriobacteria immobilized by SA

图2 PVA 固定的反硝化细菌小球Fig.2 The balls of denitriobacteria immobilized by PVA

图3 SA+PVA 固定的反硝化细菌小球Fig.3 The balls of denitriobacteria immobilized by PVA and SA

由图1 ～图3 可知，以SA 固定的反硝化细菌小球，制备时易成球，不易粘连较透明，交联后的小球强度好，抗挤压，弹性好。但在实验过程中发现小球有明显的消溶现象。48 h 后小球体积减少1/2，预计4 ～5 d 小球会完全破碎溶解。以PVA 固定的反硝化细菌小球，未滴前透明度最好，小球不易成型也不易变色，易粘连，不易分开，形成串珠状，交联后的小球强度低，挤压后变形且不可恢复，粘度大，弹性差。以PVA+SA 混合物固定的反硝化细菌小球，小球大小均匀，形状饱满且不易粘连。交联后，在强度、抗挤压能力、弹性、大小方面与SA 小球相似。小球的颜色则介于SA 的半透明和PVA 的白色之间。试验过程中，并没有像SA 小球那样明显的消融现象，反应过程现象更接近于PVA 小球。

2.2 3 种不同固定化方法对反硝化细菌降解亚硝酸盐的影响

将分别以SA、PVA 和PVA +SA(v/v =1∶1)包埋制备的反硝化细菌制成的小球置于模拟养殖水体中，分别测定培养24，48 h 的NO2－-N 去除率，并观察小球变化情况，结果见图4 。

图4 3 种不同方法固定化小球对-N 脱除率的影响Fig.4 The effect of balls immobilized by different materials on removal rate of nitrite

由图4 可知，3 种不同材料固定的反硝化细菌小球对NO2－-N 的去除率在24 h 均达到80%以上，去除率由高到低依次为:PVA、PVA + SA 和SA 小球，分别为85%，84%和82%。48 h 后3 种小球的去除率较24 h 都有所提高，但去除率最高的仍为PVA 小球，达到88%，其次PVA + SA 小球，达到87%。实验过程中发现，SA 小球虽然有消融现象，但弹性和机械强度较好;而PVA 小球的弹性和机械强度较差，有比较严重的吸附粘连和膨胀现象，容易结成团状，减小接触面积，从而影响NO2－-N 的去除率;PVA+SA 混合小球的弹性、通透性和机械强度介于两者之间，可减少小球的消融和粘连现象，增加小球的机械强度。

2.3 温度对PVA +SA 反硝化细菌小球降解亚硝酸盐氮效果的影响

以PVA+SA 混合包埋小球为研究对象，研究了不同温度下不同时间反硝化细菌对NO2－-N 去除率的影响，结果见图5。

图5 温度对PVA+SA 混合包埋小球-N 去除率的影响Fig.5 The effect of temperature on removal rate of nitrite of balls immobilized by PVA and SA

由图5 可知，24 h 时在20 ～32 ℃范围内，随着温度的升高，亚硝酸盐氮去除率呈增加的趋势，32 ℃去除率达到82%，而20 ℃去除率仅为45%。随着处理时间延长，20，25，28 ℃三个温度的去除率都有所增加，但32 ℃时，48 h 和72 h 的去除率反而有所下降，反而低于相同时间28 ℃的去除率。原因可能为在24 h 时，适当提高温度有利于反硝化细菌-N 的去除，但随着时间的延长，高温反而使反硝化细菌酶活性有所降低，因此采用28 ℃作为较合适的温度。

2.4 PVA 和SA 不同比例对NO2－-N 去除效果的影响

选取PVA 与SA 比例为1∶1，5∶1 和10∶1 分别包埋制成小球，命名为小球a、小球b 和小球c。考察了PVA 和SA 比例对NO2－-N 去除率的影响，结果见图6。

图6 不同比例包埋小球对-N 去除率的影响Fig.6 The effect of different proportion on removal rate of nitrite of balls immobilized by PVA and SA

由图6 可知，3 种小球在24 h 时的亚硝酸盐氮去除率基本相同，随着时间的延长，3 种小球的去除率都有所增加，但增加幅度不大，尤其是小球a。在48 h 和72 h 时，小球c 的去除率高于小球b，但相差不大。PVA 和SA 的不同比例影响了细胞的成活率、小球和溶液的接触面积等，最终影响细胞的生物活性和反应速率。因为1∶1 和1∶5 比例的混合小球都存在轻微的消融现象，小球c 的比例1∶10 更适用于实际应用。

2.5 碳源对亚硝酸盐氮去除效果的影响

以混合小球c 为考察对象，分别以柠檬酸、蔗糖、乙醇、葡萄糖、甲醇作为碳源，碳源浓度均为280 mg/L，结果见图7。

图7 碳源对小球-N 去除率的影响Fig.7 The effect of different carbon sources on removal rate of nitrite

由图7 可知，小球c 利用这5 种不同碳源进行反硝化作用时，去除率有很大的不同。24 h 时，利用蔗糖和乙醇作为唯一碳源时，亚硝酸盐氮去除效果最好，为35%和37%。当以葡萄糖和柠檬酸作为唯一碳源时，反硝化效果较蔗糖和乙醇低，去除率为29%和30%，最低的是甲醇为21%。随着时间的延长，除了柠檬酸外，其它4 种碳源的去除率都有了较大程度的提高。以葡萄糖作为唯一碳源时，虽然在前期反硝化效果不及蔗糖，但后期去除效果有明显增加，96 h 时，去除率由高到低依次为葡萄糖81%、乙醇71%、甲醇63%、蔗糖55.6%、柠檬酸38.6%。因此，可以考虑以葡萄糖作为较合适的碳源。

2.6 碳氮比对亚硝酸盐氮去除效果的影响

对混合小球c 进行碳氮比考察，结果见图8。

由图8 可知，在4 种不同的碳氮比条件下，随着时间的延长，NO2－-N 的去除率都随之增大，并且除去碳氮比为25∶1 时，其它3 种比例都在48 h 时去除率达到较大值，之后增幅不大。同时，随着碳氮比的减小，去除率相应增加。可能的原因是，碳氮比越大，碳源相对越丰富，这使包埋的反硝化细菌有足够的能源先满足自身的生长代谢而延缓了反硝化作用的速率，同时足够的碳源也使小球维持较稳定的去除速率。但在实际应用中，碳源过多不但会使成本升高，也会延缓去除率的增加，延长达到理想去除效果的时间。鉴于图8 的结果，选用2.5∶1 为较适宜的碳氮比。

图8 不同C/N 比对包埋小球去除率的影响Fig.8 The effect of different C/N on removal rate of nitrite of balls

3 结论

本实验所考察的3 种反硝化细菌固定化方法中，以海藻酸钠和聚乙烯醇为混合材料制备的小球弥补了单一材料的不足，兼具两种方法的优势。该种方法最适条件为:温度28 ℃，聚乙烯醇和海藻酸钠的比例为10∶1，葡萄糖为碳源，碳氮比2.5∶1，亚硝酸盐氮的最大去除率72 h 能达到92%。

［1］ 吴美仙，李科，张萍华.反硝化细菌及其在水产养殖中的应用［J］.浙江师范大学学报:自然科学版，2008，31(4):467-471.

［2］ 姚秀清，刘秀梅. 反硝化细菌降解养殖水体亚硝酸盐的研究［J］.应用化工，2014，43(5):871-873.

［3］ 郑黎明，蒋海涛，王罗春，等. 包埋固定化微生物处理含氮废水的研究进展［J］. 环境科学与管理，2011，36(11):86-90.

［4］ 李芳芳，齐树亭，石玉新.新型固定化硝化细菌和好氧反硝化细菌处理氨氮废水［J］. 生态科学，2010，29(5):467-471.

［5］ Yu Lu，Liu Yanjun，Wang Gejiao. Identification of novel denitrifying bacteria Stenotrophomonas sp.ZZ15 and Oceanimonas sp.YC13 and application for removal of nitrate from industrial wastewater［J］. Biodegradation，2009，20:391-400.

［6］ Christopher B Hill Eakalak Khan.A comparative study of immobilized nitrifying and co-immobilized nitrifying and denitrifying bacteria for ammonia removal from sludge digester supernatant［J］. Water Air Soil Pollut，2008，195:23-33.