益气活血药对舒张功能不全大鼠心功能及钙转运的干预研究❋

李思耐，石晓璐，武乾，林谦△

(1.北京中医药大学东方医院心血管内科，北京100078; 2.中国中医科学研究院医学实验中心，北京100700)

益气活血药对舒张功能不全大鼠心功能及钙转运的干预研究❋

李思耐1，石晓璐2，武乾2，林谦1△

(1.北京中医药大学东方医院心血管内科，北京100078; 2.中国中医科学研究院医学实验中心，北京100700)

目的:研究益气活血药对舒张功能不全大鼠心肌细胞心功能及钙转运的干预作用。方法:建立压力负荷致舒张功能不全大鼠模型，按干预因素分为假手术组、模型组、益气组、活血组、益气活血组。造模后给药8周检测大鼠心功能，分离心肌细胞，检测心肌细胞收缩、舒张功能及钙瞬变、胞内钙浓度。结果:益气活血组舒张早/晚期峰值血流速度(E/A)较模型组升高;各给药组舒张50%时间(TR50)较模型组均显著降低，其中益气活血组效果最明显;活血组、益气活血组钙瞬变衰减常数(Tau)较模型组缩短;益气活血组舒张期钙浓度较模型组降低。结论:益气活血药通过改善心肌细胞钙转运能力，提高心肌细胞舒张功能，改善心脏舒张功能，并降低心衰心肌细胞钙浓度，从而预防心衰室性心律失常的发生。

益气活血药;心室功能障碍;心肌细胞;钙

左室舒张功能不全是高血压病靶器官损害的表现之一，可先于左室肥厚发生，表现为二尖瓣脉冲式频谱多普勒血流频谱的改变，是慢性心力衰竭(心衰，Chronic Heart Failure，CHF)早期重要的病理生理环节之一［1］。中医治疗CHF具有一定的特色和优势，学者普遍认为，气虚血瘀是CHF的基本病机之一，并贯穿始终，是心衰发展恶化的重要因素［2］。目前从钙转运角度治疗CHF及其并发心律失常的西药研究并不多见，尽管中医临床治疗CHF具有一定的特色和优势，但中药干预钙转运的机制研究鲜有报道。本实验通过研究益气活血药对舒张功能不全大鼠心肌细胞收缩、舒张功能及钙转运的干预作用，探讨益气活血药改善早期CHF患者预后的作用机制，为临床应用益气活血法治疗CHF提供实验依据，并为防治CHF室性心律失常提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物清洁级健康雄性SD大鼠，体质量(210±10)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证编号SCXK(京)2012-0001)，饲养于中国中医科学院中药研究所SPF级动物房，恒温恒湿，大鼠专用无菌饲料，专人喂养。

1.1.2 药品与试剂中药党参、黄芪、丹参、三七购自北京同仁堂，北京中医药大学东方医院制剂室进行提取物制备;注射用青霉素钠购自华北制药公司(批号H13020657);水合氯醛为国产分析纯试剂;无钙台氏液(Tyrode solution，mmol/L):NaCl 140.0、KCl 5.4、MgCl21.0、HEPEs 10.0(Merck，Germany)、D-Glucose 10.0(AMRESCO，USA)，NaOH调至PH7.4;KB液(mmol/L):KOH 80.0、KCl 40.0、KH2PO425.0、MgSO43.0、L-Glutamic 50.0、Taurine 20.0、HEPEs 10.0、EGTA 1.0(Acros Organics，Belgium)、D-Glucose 10.0，KOH调至PH7.2;消化液:0.6%胶原酶B(Collagenasetype2，Worthington)、0.6%BSA(Bovine serum slbumin，Maverick)、30 μmol/L Ca2+台氏液;Flou-2·AM购自美国Invitrogen公司。

1.1.3 仪器可视化动缘探测系统(IonOptix，USA);双向激发荧光光电倍增成像系统(IonOptix，USA);电子刺激器SEN 27103(IonOptix，USA);倒置显微镜(Nikon，Japan);小动物超声心动检测系统(Vevo770ultrasoundsystem，VisualSonicsInc，USA);Langendorff心脏灌流系统;冷光单孔手术灯、分析天平、电子秤、电脑、无菌手术器械、研磨器、移液器等。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药适应性喂养1周后，将大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、益气组、活血组、益气活血组共5组。除假手术组行假手术外，其余各组大鼠均行腹主动脉缩窄术，术后1 d开始灌胃给药。益气组给予中药提取物黄芪(3 g/ kg/d)+党参(1.5 g/kg/d)灌胃;活血组给予中药提取物丹参(1.5 g/kg/d)+三七(1.5 g/kg/d)灌胃;益气活血组给予中药提取物黄芪(3 g/kg/d)+党参(1.5 g/kg/d)+丹参(1.5 g/kg/d)+三七(1.5 g/ kg/d)灌胃;假手术组、模型组给予生理盐水灌胃;各组灌胃总量1 ml/100 g保持一致，给药8周。

1.2.2 腹主动脉缩窄术大鼠称重后，给予10%水合氯醛(0.5 ml/100 g)腹腔注射麻醉。麻醉成功后，将大鼠仰位于鼠板固定、剪毛，皮肤无菌操作后于剑突下腹中线处切开皮肤和肌肉，切口长约1.0～1.5 cm，于肾动脉分支上方0.5 cm处分离腹主动脉约1 cm，将8号注射器针头平行置于腹主动脉上，用4号手术线将腹主动脉和注射针头一同结扎，然后缓慢抽出针头，使大鼠腹主动脉直径减少40%～50%，腹腔注射青霉素20 U，关腹并逐层缝合肌肉及皮肤，连续3 d，每天给予20 U青霉素腹腔注射预防感染，各组均常规喂养。假手术组分离腹主动脉但不用丝线结扎，其余步骤同上［3］。

1.2.3 超声心动检测利用Vevo 770高分辨率小动物超声心动检测系统，检测术后8周大鼠心脏收缩、舒张功能。大鼠脱毛后用3%异氟烷吸入麻醉，仰卧位固定于37℃恒温加热板上，持续吸入1.5%～3%异氟烷，四肢与心电图电极相连用于检测心率并记录心电图。探头置于大鼠胸骨前，2D超声显示左室短轴切面，于乳头肌水平应用M模式记录左心室运动情况，测量心率(HR)、左室舒张末内径(LVIDd)和左室收缩末内径(LVIDs)，计算左室射血分数(EF)及短轴缩短率(FS);在超声四腔面，将取样容积置于二尖瓣瓣口，采用PW模式测定二尖瓣舒张早期峰值血流速度E和舒张晚期峰值血流速度A，计算E/A，并通过PW图像测量等容舒张时间(IVRT);所有超声数据连续测量3个心动周期计算均值［4］。

1.2.4 心肌细胞急性分离各组大鼠术后8周超声检测后，腹腔注射2000单位肝素，20 min后用10%水合氯醛溶液(0.5ml/100 g)腹腔注射麻醉、开胸，迅速取出带有一段主动脉的心脏，修剪后迅速挂于Langendorff装置上，保持温度37℃，以无钙台氏液逆行灌流5 min，随后用含有消化液逆行灌流约20～30 min。当心脏松软、颜色变浅时终止消化，取下心脏，用30 ml无钙台氏液灌流冲洗残余消化液，然后在KB液中剪取左心室，用眼科剪剪碎，以吸管吹打，细胞用尼龙网过滤，室温静置5 min后弃去上清液，更换KB液1次，10 min后再次更换KB液，静置1 h后弃去上清液，经不同钙离子浓度的台氏液逐步复钙，最后细胞保存在正常有钙台氏液中(1.2mmol/L Ca2+)备用。所有溶液使用前需37℃下充氧20 min［5］。

1.2.5 心肌细胞收缩、舒张功能及钙瞬变的测定分离好的心肌细胞用Flou-2·AM(0.5 μM)在室温下负载10 min后，将细胞置于倒置显微镜下的细胞槽中，用含钙台氏液(1.2 mmol/L Ca2+)灌流细胞，并给予细胞不同频率(0.5 Hz、1.0 Hz、2.0 Hz)的场刺激(5 V，4 ms)，使用可视化动缘探测系统测定心肌细胞的机械功能，使用双向激发荧光光电倍增成像系统检测荧光强度。用收缩分数(fraction of shortening，FS)评价细胞收缩功能，用舒张50%时间(time-to-50%relaxtion，TR50)评价细胞舒张功能。用不同波长的激发光(340 nm、380 nm)照射细胞时发出的荧光密度(fura-2 fluorescence intensity，FFI)比值(340/380 ratio)代表心肌细胞内钙离子浓度的变化，记录钙瞬变幅度(△FFI)、钙衰减时间常数(Tau)、舒张期钙浓度(舒张期FFI)以及收缩期钙浓度(收缩期FFI)［5］。

1.2.6 统计学方法采用SPSS 13.0系统软件进行统计分析，以均值±标准差(±s)表示，2组间数据比较用t检验，多组间数据比较用单因素方差分析，采用Prism 5.0软件绘制图表。

2 结果

2.1 益气活血药对舒张功能不全大鼠心功能的影响

表1显示，与假手术组比较，术后8周模型组大鼠E/A明显下降(P＜0.05)，IVRT明显延长(P＜ 0.05)，HR、EF、FS比较差异无统计学意义。各给药组及模型组间E/A比较差异有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较，益气活血组E/A升高(P＜0.05)，益气组、活血组E/A有下降趋势但无统计学意义;与模型组比较，各给药组IVRT均缩短，其中益气活血组缩短最为明显，但差异无统计学意义(P =0.055)，各组间HR、EF、FS比较差异无统计学意义。结果表明，益气活血药联合应用可以改善CHF早期舒张功能不全大鼠心脏的舒张功能，而单独使用益气药或活血药无效。

表1 益气活血药对舒张功能不全大鼠心功能的影响

2.2 益气活血药对舒张功能不全大鼠心肌细胞收缩、舒张功能的干预作用

当以不同频率(0.5、1.0、2.0 Hz)刺激心肌细胞时，假手术组FS分别为(7.46±2.44、7.01±1.94、10.43±1.94)%，模型组FS分别为(2.31±1.39、3.24±2.16、4.16±2.73)%，模型组与假手术组比较均显著下降(P＜0.01)(图1A);假手术组TR50分别为(62.26±14.12、62.58±18.64、52.26± 7.61)ms，模型组TR50分别为(328.25±107.94、226.95±45.81、154.05±20.66)ms，模型组与假手术组比较均显著延长(P＜0.01)(图1B)。各给药组FS与模型组比较有升高趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)(图1C);各给药组TR50与模型组比较明显降低，其中以益气活血组降低最为明显(P＜0.01)，TR50分别为(108.53±33.31，93.73± 32.23，68.19±21.92)ms(图1D)。结果表明，益气活血药联合应用可以缩短受损心肌细胞舒张时间，改善舒张功能，且效果较单独应用益气药或活血药明显。

图1 各组心肌细胞收缩、舒张功能比较

图2 模型组与假手术组心肌细胞钙瞬变的比较

2.3 益气活血药对舒张功能不全大鼠心肌细胞钙瞬变的干预作用

在不同频率刺激下(0.5、1.0、2.0 Hz)的模型组钙瞬变幅度ΔFFI与假手术组比较差异无统计学意义(图2A);以0.5Hz刺激时模型组Tau(362.40± 68.33 ms)，比假手术组(206.05±64.28)ms明显升高(P＜0.01)，其他频率下2组Tau未见明显差异(图2B)。以2.0 hz刺激时模型组细胞舒张期钙浓度(0.625±0.107，340/380 ratio)较假手术组(0.490±0.043，340/380 ratio)明显升高(P＜0.01) (图2C)，模型组收缩期钙浓度(0.872±0.088，340/ 380 ratio)较假手术组(0.800±0.094，340/380 ratio)升高(P＜0.05)(图2D);模型组细胞舒张期钙浓度及收缩期钙浓度随刺激频率的增加而升高，变化趋势均较假手术组明显。这一结果提示，模型组细胞钙转运能力受损，并处于钙超载状态。

益气组、活血组钙瞬变幅度ΔFFI在不同频率刺激下较模型组均有不同程度下降，而益气活血组ΔFFI与模型组比较未见明显变化(图3A);以2.0 hz刺激时，活血组(96.50±32.00 ms)、益气活血组(103.85±23.66 ms)钙瞬变Tau较模型组(127.47 ±43.27 ms)缩短(P＜0.05，P＜0.05)，益气组(114.17±26.28 ms)未见差异，其他频率刺激未见差异(图3B);以2.0Hz刺激时，益气活血组舒张期钙浓度(0.546±0.066，340/380 ratio)较模型组(0.608±0.079，340/380 ratio)降低(P＜0.05)，其他给药组未见差异(图3C);以2.0Hz刺激时，益气组(0.798±0.106，340/380 ratio)、活血组(0.772± 0.080，340/380 ratio)、益气活血组(0.790±0.107，340/380 ratio)收缩期钙浓度较模型组(0.878± 0.087，340/380 ratio)均明显降低(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)(图3D);各给药组细胞舒张期钙浓度及收缩期钙浓度随刺激频率的增加而升高，但变化趋势较模型组均明显减小。结果表明，益气活血药联合应用可以加速舒张期钙清除速度，同时降低舒张期和收缩期钙离子浓度及避免钙超载，而单独使用益气药或活血药对舒张期钙离子浓度的影响不明显。

图3 益气活血药对心肌细胞钙瞬变的干预作用

3 讨论

本研究结果表明，压力负荷增加能够引起心脏舒张功能不全，心肌细胞舒、缩功能下降且处于钙超载状态;益气活血药能够改善心肌细胞舒张功能，缓解钙超载，改善心脏的舒张功能。既往研究表明，益气活血药黄芪、丹参能够调节肥大心肌细胞内钙瞬变异常，从而改善心肌细胞兴奋-收缩偶联，其分子学机制与RyR、SERCA、PLB等钙转运关键分子的功能或蛋白表达作用相关［6-8］。钙离子是心肌细胞中重要的阳离子，参与兴奋-收缩偶联以及动作电位的形成，在心肌细胞机械运动及电生理活动中起关键作用。研究表明，CHF模型动物心肌细胞钙瞬变幅度下降，收缩幅度减小;同时在大多数CHF模型中，心肌细胞钙离子浓度下降速度减慢，舒张速度降低［9］。此外，由于心衰细胞肌浆网钙回摄障碍或自发钙释放增加，细胞内舒张期钙离子浓度升高，形成钙超载，驱动钠/钙交换体(Na+/Ca2+exchanger，NCX)电流增强，诱发延迟后除极(Delayed afterdepolarization，DAD)，这是心衰室性心律失常触发活动发生的机制之一［10］。综上所述，益气活血药能够通过提高心肌细胞钙转运能力，从而改善心脏舒张功能，预防室性心律失常的发生。

［1］拓西平.老年舒张性心衰的药物治疗［J］.中国社区医师，2012(4):13.

［2］黄华，司晓晨.舒张性心力衰竭的中医研究进展［J］.现代中西医结合杂志，2009(31):3914-3916.

［3］柏胜男.大鼠舒张性心力衰竭动物模型的建立［J］.黑龙江医药，2011(6):897-898.

［4］Henry WL，DeMaria A，Gramiak R，et al.Report of the AmericanSocietyofEchocardiographyCommitteeon NomenclatureandStandardsinTwo-dimensional Echocardiography［J］.Circulation，1980，62(2):212-217.

［5］Ge W，Guo R，Ren J.AMP-dependent kinase and autophagic flux are involved in aldehyde dehydrogenase-2-induced protection against cardiac toxicity of ethanol［J］.Free Radic Biol Med，2011，51(9):1736-1748.

［6］孙娅楠，李思耐，马淑骅，等.黄芪、丹参注射液对乳鼠肥大心肌细胞钙瞬变的影响［J］.中华中医药杂志，2013(5): 1356-1360.

［7］孙娅楠，农一兵，林谦.黄芪、丹参对肥大心肌细胞SERCA2a、PLB mRNA表达的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2011(11):1214-1216.

［8］孙娅楠，农一兵，林谦.黄芪及丹参对肥大心肌细胞肌浆网钙转运干预作用研究［J］.中华中医药杂志，2012(1):178-183.

［9］Bers DM.Altered cardiac myocyte Ca regulation in heart failure［J］.Physiology(Bethesda，Md.)，2006，21:380-387.

［10］LauritaKR，RosenbaumDS.Mechanismsandpotential therapeutic targets for ventricular arrhythmias associated with impaired cardiac calcium cycling［J］.J Mol Cell Cardiol，2008，44(1):31-43.

Intervention of Yiqi Huoxue drugs on cardiac function and calcium transport in diastolic dysfunction rats

LI Si-nai1，SHI Xiao-lu2，WU Qian2，LIN Qian1△
(1．Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China; 2．Medical Experimental Center，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China)

Object:To explore the effects of reinforcing qi and promoting blood circulation on cardiac function and calcium transport in rats with diastolic dysfunction.Methods:The rat model of diastolic dysfunction was established by pressure-overload.According to the intervention，the rats were randomly divided into 5 groups of sham-operation，control，reinforcing qi(RQ)，promoting blood circulation(PBC)，reinforcing qi and promoting blood circulation(RQ＆PBC). Cardiac function was detected after 8 weeks of intervention，then cardiomyocytes were isolated.The cardiomyocyte contractility and calcium transport was tested.Results:E/A ratio was higher in RQ＆PBC group than in control group; Compared with control group，50%time of relaxtion was reduced in RQ group，PBC group and RQ＆PBC group，among which the effect of RQ＆PBC group was the most significant;Tau were lower in PBC group and RQ＆PBC group than in control group;Compared with control group，the diastolic calcium concentration of RQ＆PBC group was reduced. Conclusion:The treatment of reinforcing qi and promoting blood circulation improved the ability of calcium transport and relaxtion in cardiomyocytes，leading to increased cardiac diastolic function and reduced cardiomyocyte calcium concentration，thus protected heart against ventricular arrhythmia.

Reinforcing qi and promoting blood circulation;Ventricular dysfunction;Cardiomyocyte;Calcium

R285.5

:B

:1006-3250(2015)05-0520-04

2015-03-12

国家自然科学基金资助项目-基于心肌细胞钙稳态研究益气活血药对舒张性心功能不全的干预机制(81373779);北京市自然科学基金资助项目-益气活血化瘀法对慢性心衰心肌细胞钙相关电生理重构干预作用研究(7122092)

李思耐，男，北京人，在读博士，从事中西医结合防治心血管疾病的临床与研究。

△通讯作者:林谦，女，主任医师，博士研究生导师，从事中西医结合防治心血管病的临床及基础研究。