益肾通络复方含药血清对兔骨髓间充质干细胞体外增殖和成骨分化的影响❋

郭杨，马勇，△，成吉华，赵丹，沈李李，王培民

(1.南京中医药大学骨伤研究所，南京210023;2.南京中医药大学附属医院，南京210029)

益肾通络复方含药血清对兔骨髓间充质干细胞体外增殖和成骨分化的影响❋

郭杨1，马勇1，2△，成吉华1，赵丹1，沈李李1，王培民2

(1.南京中医药大学骨伤研究所，南京210023;2.南京中医药大学附属医院，南京210029)

目的:观察益肾通络含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和成骨分化的影响。方法:分离BMSCs分为对照组(A组)、低浓度组(B组)、中浓度组(C组)、高浓度组(D组)、阳性对照组(E组)，干预后检测细胞增殖和成骨分化情况。结果: CCK-8:干预24 h、72 h后B、C、D组均高于A组，干预120 h后B组高于A、C、D组。ALP活性干预7、14 d后B、C、D组高于A组，但低于E组。结论:益肾通络含药血清能促进BMSCs体外增殖并诱导其成骨分化。

益肾通络;骨髓间充质干细胞;细胞增殖;成骨分化

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)由于其具有自我更新能力且易分离、多向分化潜能等特性，为修复各种类型的骨缺损及治疗股骨头坏死开拓了宽阔的前景，成为众多学者关注的焦点。近年来有研究表明［1］，中医药可以促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化。本实验采用以益肾通络为主的中药复方，探寻其对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响，以进一步研究其作用机制。

1 材料

1.1 实验对象

健康2周龄纯种新西兰大白兔1只，体质量186 g;健康3月龄纯种新西兰大白兔4只，体质量2.5 kg，由南京中医药大学动物实验中心提供(动物合格证号SCXK(苏)2012-008)。

1.2 主要实验试剂

益肾通络复方:鹿角胶20 g，骨碎补20 g，三七粉15 g，水蛭15 g，土鳖虫15 g，黄芪15 g，当归15 g，枸杞子15 g，地龙12 g，鸡血藤12 g，杜仲12 g，白术10 g，白芍10 g，桑寄生10 g，淫羊藿10 g，甘草5 g，共16味中药(南京中医药大学附属医院中药房提供);Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒(日本同仁化学研究所);碱性磷酸酶活性测试盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 主要器材与仪器

倒置式系统相差显微镜(日本Olympus); ELx800酶标仪(美国BioTek);低速离心机(德国Heraeus);JY88-IIN超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 益肾通络复方含药血清的制备

取健康3月龄纯种新西兰大白兔4只，体质量2.5 kg，按随机数字表法分为灌胃组和对照组每组各2只，灌胃组按7.2 g/kg·d给药益肾通络复方浓缩液(相当于含生药量1 g/ml)，对照组按7.2 g/kg· d剂量灌服生理盐水，每天1次，连续7 d，于最后1次灌胃后1 h行麻醉下颈动脉取血，4℃静置过夜后3000 r/min离心20 min，分离上层血清，56℃水浴30 min灭活，0.22 μm针头式过滤器过滤血清，-20℃保存备用。

2.2 兔骨髓间充质干细胞的分离和培养

2.2.1 原代细胞培养取健康2周龄纯种新西兰大白兔1只，空气栓塞处死，无菌条件下剥离出股骨、胫骨，剪断两端骨骺，用20 ml注射器吸取PBS溶液反复冲洗骨髓腔和干骺端，直至骨髓腔变白，收集冲洗溶液至离心管内，1200 r/min离心5 min弃上清液，加入含10%胎牛血清培养基吹打重悬，接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中静置培养，7 d后换液。弃原培养基，PBS冲洗2次，换新鲜培养基继续培养，此后每3 d换1次液，待细胞铺满皿底80%～90%时，按照1∶3进行传代培养。

2.2.2 传代细胞培养传代培养步骤:待细胞生长增殖并铺满培养瓶底80%～90%时，弃原培养基加入PBS冲洗2次，加入胰酶-EDTA消化液，在倒置显微镜下观察细胞形态变圆，呈悬浮游离状，立即加入10%胎牛血清培养基终止消化，800 r/min离心5 min弃上清液，加入培养基吹打重悬，分别接种于3个培养皿中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中静置培养。

2.3 细胞增殖活性检测

选用第3代BMSCs细胞，以1×104/ml细胞密度、100 μL/孔接种于3块96孔培养板中，按随机数字表法分为空白对照组(A组)、低浓度组(B组)、中浓度组(C组)和高浓度组(D组)，每组5个复孔培养24 h后，空白对照组加入含10%对照血清培养基，低、中、高浓度组分别加入5%、10%、15%含药血清培养基，参照CCK-8试剂说明书，于干预24 h、72 h、120 h进行细胞增殖活性检测，酶标仪测定450 nm处的吸光度(OD值)。

2.4 碱性磷酸酶活性检测

选用第三代BMSCs细胞，以5×104/ml细胞密度，1 ml/孔接种于2块24孔培养板，按随机数字表法分为空白对照组(A组)、低浓度组(B组)、中浓度组(C组)、高浓度组(D组)、阳性对照组(E组)，每组4个复孔，培养24 h后，对照组加入含10%对照血清培养基，低、中、高浓度组分别加入5%、10%、15%含药血清培养基，阳性对照组加入成骨诱导液(含10%空白兔血清、10-8mmol/L地塞米松﹑10 mmol/L β-甘油磷酸钠﹑50 mg/L维生素C的培养基)，于干预第7、14天弃培养基，用胰酶-EDTA消化后，超声破碎细胞(冰水浴，每3～5 s超声1次，间隔4次)，参照说明书进行碱性磷酸酶活性检测。

2.5 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析，不满足方差分析条件时釆用Wilcoxon秩和检验，统计数据以均数±标准差(±s)表示，P＜0.05，P＜0.01为差异有统计学意义，P＞0.05为差异无统计学意义。

3 结果

3.1 原代和传代细胞形态学观察

原代培养7 d见散在少量贴壁细胞，呈梭形、多角形或不规则状，周围有大量杂质圆形细胞(图1-A);传代1次培养后贴壁细胞数量明显增多，细胞呈梭形、多角形，杂质细胞明显减少(图1-B);第2次传代后细胞增殖快，呈多角形或不规则状，培养5 d即可铺满皿底(图1-C);至第3代BMSCs细胞外观呈长梭形，呈紧密排列，符合BMSCs细胞生长形态特征(图1-D)。

图1 骨髓间充质干细胞原代和传代细胞形态学观察

3.2CCK-8细胞增殖结果

表1显示，干预24 h后各浓度含药血清组OD值大于空白对照组(P=0.011，0.000，0.000＜0.05)，其中中浓度和高浓度组OD值高于低浓度组(P=0.002，0.000＜0.01);干预72 h后，各浓度含药血清组OD值均大于空白对照组，差异有统计学意义(P=0.000，0.000，0.001＜0.01)，各浓度组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05);干预120 h后，低浓度组高于空白对照组、中浓度和高浓度组，差异有统计学意义(P=0.001，0.004，0.000＜0.01)。

3.3 碱性磷酸酶活性检测结果

表2显示，干预7、14 d后，各浓度组和阳性对照组碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性均高于空白对照组，差异有统计学意义(P=0.000＜ 0.01)，各浓度组之间ALP活性随着浓度升高而增大(P=0.000＜0.01)，阳性对照组ALP活性高于其余各组，差异有统计学意义(P=0.000＜0.01)。

表1 CCK-8比色法检测益肾通络含药血清对BMSCs增殖的影响(±s)

表1 CCK-8比色法检测益肾通络含药血清对BMSCs增殖的影响(±s)

注:与对照组比较:△P＜0.01，△△P＜0.05;与低浓度组比较:▲P＜0.01

组别例数OD 值24 h72 h120 h空白对照组(A组)52.6176±0.03912.9554±0.04403.0748±0.1333低浓度组(B组)52.7046±0.0279△△3.1070±0.0537△3.3260±0.0639△中浓度组(C组)52.8140±0.0589△▲3.1142±0.0288△3.1266±0.0582▲高浓度组(D组)52.8868±0.5741△▲3.0616±0.0433△2.9930±0.0966▲

表2 益肾通络含药血清对BMSCs碱性磷酸酶活性的影响(±s)

表2 益肾通络含药血清对BMSCs碱性磷酸酶活性的影响(±s)

注:与空白对照组比较:△P＜0.01;与阳性对照组比较:▲P＜0.01

组别例数碱性磷酸酶(U/gprot) 7 d14 d空白对照组(A)40.4380±0.02390.3387±0.0035低浓度组(B)40.9377±0.0350△0.6341±0.0217△中浓度组(C)41.0462±0.0533△0.8729±0.0452△高浓度组(D)41.2368±0.0114△1.0098±0.0346△阳性对照组(E)41.5002±0.0434△▲1.2986±0.0482△▲

4 讨论

CCK-8法是利用水溶性四唑盐WST-8被细胞内脱氢酶氧化还原后生成的橙黄色甲臢染料，能够溶解在组织培养基中，生成的甲臢量与活细胞数量呈正比，被认为是正确评价细胞增殖情况的一种客观指标。本实验发现，干预24 h、72 h后各浓度含药血清组比较，空白对照组均能促进BMSCs的增殖，24 h低浓度含药血清的增殖效应低于中、高浓度组，但随着时间增加，低浓度含药血清增殖效应高于空白对照组、中浓度和高浓度组，说明低浓度含药血清具有稳定促进BMSCs体外增殖的作用。

ALP作为成骨细胞分化的早期标志物，在基质合成期开始出现，钙化期达到高峰［2］，是成骨细胞分化成熟的标志性酶之一，能够反映成骨细胞合成I型胶原、形成骨基质的能力［3］，故其可作为成骨细胞功能状态的一个重要指标来衡量MSCs成骨分化的程度［4］。本实验选用其作为观察益肾通络复方促BMSCs成骨分化的实验指标，结果证实，益肾通络复方含药血清具有成骨诱导作用，其效应随着含药血清浓度而增加，但其效应弱于成骨诱导液，表明益肾通络含药血清能在一定程度上促进BMSCs体外成骨分化。

骨髓间充质干细胞具有成骨分化的特性，这与中医“肾藏精，精生髓，髓生骨”的理论相吻合，因为骨髓间充质干细胞来自于骨髓，而在特定条件下能向成骨转化，即实现“髓生骨”，因此BMSCs属于中医学“髓”的范畴。本实验采用的益肾通络方是江苏省中医院许建安教授治疗股骨头坏死的临床验方［5］。本方重用鹿角胶、骨碎补温补肾阳，三七粉、水蛭、土鳖虫、地龙活血通络，黄芪、白术、当归、枸杞子、鸡血藤补气血、调经络，杜仲、桑寄生、淫羊藿补肝肾强筋骨，白芍、甘草缓急止痛。近年来有学者研究发现，10%菟丝子含药血清有促进MSCs增殖的作用，可能与其促进BMP-2 mRNA表达有关［6］。徐凌霄等［7］研究表明，大鼠间充质干细胞经左归丸含药血清诱导后可以分化为成骨细胞，能够促使诱导过程中碱性磷酸酶含量表达增加。闫宝勇等［8］研究表明，补肾壮骨中药可以调节成骨细胞分泌OPG、RANKL的功能，从而降低破骨细胞的活力，促进成骨过程。

从上述结果可以看出，益肾通络复方可能是以BMSCs为作用靶点，通过促进其增殖和成骨分化，增加成骨细胞的数量和活性，促进骨形成，从而达到防治股骨头坏死的作用，这也为从干细胞角度研究中药防治股骨头坏死的机制提供了实验依据。

［1］杨锋，唐德志，卞琴，等.中药诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011(10):1847-1850.

［2］Kihara T，Oshima A，Hirose M，et al.Tree-dimensional visualization analysis of in vitro cultured bone fabricated by rat marrowmesenchymalstemcells［J］.Biochemicaland Biophysical Research Communications，2004，316:943.

［3］Lin HT，Tarng YW，Chen YC，et al.Using human plasma supplemented medium to cultivate human bone marrow-derived mesenchymal stem cell and evaluation of its multiplelineage potential［J］.Transplant Proc，2005，37(10):4504-4505.

［4］Shamblott MJ，Axelman J，Wang S，et al.Derivation of pluripotent stem cell form cultured human primoridial germ cell［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，95(23):13721-13726.

［5］潘文明，许建安.自拟方治疗股骨头无菌性坏死20例报道［J］.辽宁中医学院学报，2006，8(2):75

［6］黄进，张进，徐志伟.菟丝子含药血清促进骨髓间充质干细胞增殖的效应及机制［J］.中华中医药杂志，2011，26(4): 818-821.

［7］徐凌霄，高俊，张前德.左归丸含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化中碱性磷酸酶含量的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(7):149-152.

［8］闫宝勇，董福生，董玉英，等.补肾壮骨中药对成骨细胞OPG、RANKL mRNA表达的影响［J］.现代口腔医学杂志，2011，25(3):194-198.

Effect of Yishen Tongluo Prescription Containing Serum on the Osteogenic Differentiation of Rabbit Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Vitro

GUO Yang1，MA Yong1，2△，CHENG Ji-hua1，ZHAO Dan1，SHEN Li-li1，WANG Pei-min2
(1．Institute of Traumatology＆Orthopedics，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China; 2．Department of Traumatology＆Orthopedics，Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，China)

Objective:To observe the effect of serum containing Yishen Tongluo decoction on proliferation and osteogenic differentiation of the bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)in vitro.Methods:To isolate and culture the BMSCs in vitro.The cells were randomly divided into blank control group(A group)，low-concentration group(B group)，medium-concentration group(C group)，high-concentration group(D group)，and positive control group(E group).Observing the proliferation and osteogenic differentiation of BMSCs.Results:CCK-8:Intervention after 24 h，72 h，OD value of B，C，D group were greater than A group;Intervention after 120 h，OD value of B group greater than A，C，D group.ALP activity results:intervention after 7d，14 d，B，C，D group were higher than A group，but lower than E group.Conclusion:Serum containing Yishen Tongluo decoction can promote the proliferation of BMSCs in vitro and induce the osteogenetic differentiation at the same time.

Yishen Tongluo;Bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs);Cell Proliferation;Osteogenic differentiation

R285.5

:B

:1006-3250(2015)05-0508-03

2015-02-09

江苏省“六大人才高峰”资助项目(2011-WS039D)-益肾通络法干预自体骨髓间充质干细胞治疗激素性股骨头缺血性坏死的研究;江苏省中医药局科技项目(LZ09039)-中药干预复合自体骨髓间充质干细胞治疗激素性股骨头缺血性坏死的实验研究;南京中医药大学2013年大学生实践创新训练计划项目-益肾通络复方含药血清对兔骨髓间充质干细胞体外增殖及成骨活性影响的实验研究

郭杨(1985-)，男，江苏宿廷人，教师，医学博士，从事中医药防治骨关节病的临床与研究。

△通讯作者:马勇(1963-)，男，江苏扬中人，教授，博士研究生导师，从事中西医结合治疗骨关节疾病的基础与临床研究，Tel:15061529758，E-mail:cjhtcm@126.com。