絮凝、吸附和超滤预处理谷氨酰胺发酵液研究

张伟　钟丽梅　刘峰

摘 要：为进一步纯化和精制谷氨酰胺，采用絮凝、离心、活性炭吸附和超滤等方法对发酵液进行了预处理。实验优化了絮凝的最佳条件，研究了活性炭对色素的吸附能力，尝试了3种超滤膜的去蛋白和脱色效果。结果表明，壳聚糖浓度为250mg/L，壳聚糖和海藻酸钠浓度比为1∶3，pH控制在5左右，温度在25℃左右，搅拌强度为80r/min，絮凝时间为15min，絮凝效果最好，菌体去除率超过97%。用GH-15活性炭对絮凝后的发酵液脱色，脱色率达75%。使用截留分子量为6 000的超滤膜，脱色率进一步提高了43.82%，蛋白去除率为75.33%。

关键词：谷氨酰胺；壳聚糖；絮凝；吸附；超滤

中图分类号 TS20 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）06-19-04

Pretreatment on Glutamine Fermentation Broth by Flocculation，Adsorption and Ultrafiltration

Zhang Wei et al.

（College of Life Science，Fujian Normal University，Fuzhou 350108， China）

Abstract：In order to purify L-glutamine further，flocculation，centrifugalization，adsorption and ultrafiltration were used to pretreat fermentation broth.In this study，the flocculation condition has been optimized，the adsorption capacity of activated carbon （GH-15） for pigments was researched and the effect on removing proteins and decolourization of ultrafiltration was studied.This study showed the optimal condition of flocculation was as follows： chitosan 250mg/L，sodium alginate 750mg/L，pH 5，temperature 25℃，stirring intensity 80r/min，response time 15min，the removal rate of bacterial body exceeded 97%.The decolourization ratio was up to 75% with GH-15.The decolourization ratio incresed by 43.82% and the removal rate of proteins was 75.33% using the UF membrane with molecular weight cut off 6000.

Key words：L-glutamine；Chitosan；Flocculation；Adsorption；Ultrafiltration

L-谷氨酰胺是L-谷氨酸r-基酰胺化的一种氨基酸，是构成蛋白质的基本氨基酸之一，在机体内含量丰富，对于生物体的代谢具有极其重要的作用，同时也是一种极具开发前途的新药[1-3]。现阶段，谷氨酰胺的生产主要采用发酵法[4]，但由于发酵法产生的发酵液成分复杂，含有大量的菌体、蛋白质、色素等其它物质，这些杂质对于谷氨酰胺的提取与精制带来了很大困难，最终影响到谷氨酰胺的收率与质量。因此，在提取纯化之前，必须对发酵液进行预处理，目前去除菌体、蛋白质和色素等杂质的方法主要有絮凝、离心、吸附、微滤，超滤等，这些方法单独使用效果不佳，必须结合使用才能达到理想的效果。

壳聚糖是一种新型的高分子絮凝剂。海藻酸钠是一种天然多糖，具有很好的浓缩溶液、形成凝胶和成膜的能力，与絮凝剂壳聚糖结合使用，具有很好的助凝能力[5]。壳聚糖呈阳离子型，通过“桥架”作用和压缩胶体双电层结构而絮凝，对于带负电荷的菌体、蛋白具有很好的絮凝效果。对于蛋白、色素和多糖等大分子物质，超滤有很好地去除效果[6]。在超滤前，先进行絮凝、离心和吸附，大部分悬浮物被去除，在一定程度上减轻了超滤膜的污染问题。本文采用絮凝、离心、活性炭吸附和超滤等方法对谷氨酰胺发酵液进行了预处理，为谷氨酰胺生产提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和设备 谷氨酰胺发酵液（本实验室提供）；壳聚糖；海藻酸钠；GH-15活性炭，其它试剂均为AR。Ultrospec 2100 pro（Amersham Biosciences）；ZNCL-B（予华仪器有限责任公司）；SORVALL RC6+ Centrifuge（Thermo Scientific）；SBA-40D型生物传感自动分析仪（山东省科学院生物研究所）；PHS-3B型酸度计（上海精密科学仪器有限公司）；QuixStand台式膜过滤分离系统。

1.2 实验方法

1.2.1 絮凝实验 取100mL谷氨酰胺发酵液于200mL烧杯中，调节其pH。开启温度搅拌器，设定好温度和转速后，将盛有发酵液的烧杯放在其上，待温度达到设定温度后，将壳聚糖和海藻酸钠慢慢加入其中，在400r/min搅拌速度下使发酵液和絮凝剂助凝剂充分接触，2min后设定絮凝搅拌速率。

1.2.2 菌体去除率测定 以原发酵液菌含量为100%，纯水为0，原发酵液通过稀释，可以制备一系列菌含量不同的溶液，通过这些溶液和其对应的OD600值，可以制备两者之间的标准曲线。

1.2.3 沉淀和活性炭吸附实验[7] 待絮凝结束后，在8 000r/min下离心沉淀，取上清液进行活性炭吸附。吸附条件为：炭量60g，柱高30cm，柱直径2.5cm，流速93mL/h，进样液体积650mL。在390nm处测定吸光度，脱色率DR（%）=（A0-A）/A0×100，式中：A0为脱色前吸光度，A为脱色后吸光度。

1.2.4 超滤实验 发酵液经絮凝、离心沉淀和活性炭吸附后，进行超滤，超滤流程如图1所示。

1.2.5 谷氨酰胺检测 采用酸解-酶膜联用法[8]。

1.2.6 蛋白含量测定 考马斯亮蓝法。

2 结果与分析

2.1 絮凝最佳优化条件实验

2.1.1 壳聚糖浓度对絮凝效果的影响 由图2可知，当壳聚糖浓度为250mg/L时，絮凝清液OD600值降到1左右，对应的菌体除去率达到90%。当壳聚糖浓度小于250mg/L时，絮凝剂用量不足，许多菌体还未与絮凝剂絮凝而留在溶液中。当壳聚糖浓度大于250mg/L时，絮凝剂加入过量，菌体形成带絮颗粒，其不能形成网状状态，使得絮凝颗粒小，因此絮凝效果差。

2.1.2 壳聚糖和海藻酸钠的比例对絮凝效果的影响 为了增强絮凝效果，选择海藻酸钠作为助凝剂。由图3可知，壳聚糖和海藻酸钠浓度之比为1∶3时，絮凝效果最好，菌体去除率接近96%，比壳聚糖单独使用提高6%，助絮凝效果良好。[98.00

2.1.3 pH值对絮凝效果的影响 有研究表明：在pH较低时，壳聚糖和蛋白结合体系更加稳定，对外抵抗能力增强，造成这种现象的原因是低的pH有利于增强其氢键和静电力[9]。由图4可知，pH较低时，絮凝效果较好，pH在3～7，菌体去除率超过80%，其中pH值为5左右效果最佳，菌体去除率超过95%。pH值在3～5时，加入壳聚糖，壳聚糖和菌体表面作用蛋白、发酵液中少数游离蛋白结合，通过絮凝作用，菌体和少数游离蛋白沉淀下来。

2.1.4 温度对絮凝效果的影响 由图5可知，当温度在25℃左右时，絮凝效果最佳，菌体去除率超过95%。当温度较低时，由于絮凝剂与菌体结合蛋白作用频率低，絮凝反应慢，效果较差；当温度较高时，虽然絮凝剂与菌体结合蛋白作用频率增高，但絮凝体细小，沉降效果差，因此菌体去除率较低。

图5 温度对絮凝效果的影响

2.1.5 搅拌时间对絮凝效果的影响 由图6可知，絮凝时间以15min左右为宜。反应时间太短，许多菌体还未絮凝，菌体去除率较低；反应时间太长，由于搅拌，已经形成的絮凝团在剪切力的作用下遭到破坏，絮凝效果也较差。

2.1.6 搅拌强度对絮凝效果的影响 由图7可知，当搅拌强度在80r/min左右时，絮凝效果最佳，发酵液OD600接近0.5，菌体去除率达到95%左右。当搅拌强度较低时，有碍于絮凝剂与菌体结合蛋白的接触，不利于絮凝；当搅拌强度较大时，机械剪切力增强，不利于大的絮凝团的形成，而且不利于絮凝团的沉降。

2.1.7 絮凝对谷氨酰胺收率的影响以及絮凝的去蛋白效果 在絮凝反应前后，分别对发酵液的谷氨酰胺含量进行了检测，检测结果见表1。由表1可以看出，絮凝对谷氨酰胺的影响甚小，发酵液经絮凝后，谷氨酰胺的收率可达到97%左右；同时，絮凝去蛋白效果不明显，壳聚糖作为絮凝剂处理谷氨酰胺发酵液时，不能起到去蛋白的作用。

2.2 活性炭脱色实验 絮凝离心后取上清液进行脱色，脱色效果和活性炭对谷氨酰胺收率的影响见表2。由表2可知，GH-15活性炭脱色效果明显，脱色率超过75%，且对谷氨酰胺的收率影响小。

2.3 超滤实验 选择3种中空纤维滤柱（A、B、C），其截留分子量分别为30 000、10 000和6 000。在超滤前后，分别对发酵液的OD390值和蛋白质浓度进行检测，结果见表3。由表3可知，发酵液经超滤后，脱色和去蛋白效果明显，蛋白质去除率达60%～80%，脱色率进一步提高，经过活性炭吸附和超滤后，总的脱色率达85%；A、B、C相比较，C膜由于孔径小，脱色率和去蛋白率比A膜和B膜高，但增幅效果不明显，因此，在实际应用中，最好使用截留分子量稍大的滤膜。

3 结论

（1）壳聚糖用作谷氨酰胺发酵液菌体去除絮凝剂，絮凝效果较好，而且壳聚糖絮凝时几乎不影响谷氨酰胺的收率。

（2）絮凝的最佳条件：壳聚糖浓度为250mg/L，壳聚糖和海藻酸钠浓度为1∶3，pH控制在5左右，温度在25℃左右，搅拌强度为80r/min，絮凝时间以15min为宜。

（3）GH-15活性炭对谷氨酰胺发酵脱色明显，脱色率达到75%，对谷氨酰胺几乎不造成损失。

（4）超滤去蛋白效果明显，去蛋白率达到60%～80%，而且对于脱色有一定的增益作用。

参考文献

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[8]刘俊波，李思平，冯雨，等.L-谷氨酰胺测定方法的改进[J].科技致富向导，2011（27）：194-194.

[9]张超，郭晓飞，李武，等.pH 值对大豆分离蛋白/壳聚糖复合材料性能的影响[J].中国粮油学报，2013，28（10）：21-25.

（责编：张宏民）