N/P比对烟草黑胫病菌生长的影响研究

2015-04-13陈方旭黄保宏高正良等

安徽农学通报 2015年6期

陈方旭　黄保宏　高正良等

摘要：烟草黑胫病是烟草上的毁灭性病害，主要通过带菌土壤和病残体进行传染。该文通过研究不同N/P比与烟草黑胫病菌生长的关系，找出病菌生长的最适氮磷比例。试验以硝酸钠为氮源，以磷酸二氢钾为磷源，最终得出黑胫病病菌生长的最适氮磷比为3∶2，若氮肥量过多高出磷肥，病菌生长速率也很快，单施钾肥使病菌生长速率减慢。因此，在实际生产中应避免加重病害发生的施肥比例，以控制病害的发生。

关键词：烟草；黑胫病病菌；生长；氮磷比

中图分类号 S43 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）06-79-04

烟草黑胫病（Phytophora nicotiana Breda deHaan）是烟草上主要的毁灭性病害之一，最早是1896年由van Breda de Haan发现于印度尼西亚的爪哇[1]，从苗期到成株期均可发病，发病率高，分布范围广，造成的经济损失巨大。人们曾尝试用农业防治、生物防治、化学防治等多种方法控制该病害的危害，但由于该病菌的游动孢子形成速度快且数量大，侵染烟株后潜育期短、发病快，在一个生长季节可以发生多次再侵染，有时还与其他病害混合发生，因而始终无法获得理想的防治效果。烟草对于农药残留、病原菌耐药性以及在质量有特殊的要求[2]，因此，在烟草及烟草制品逐渐向无公害方向发展的趋势下，有必要从多角度探讨控制烟草黑胫病的最佳途径，以寻找新的防治方法。

N、P是微生物及烟草生长不可缺少的营养元素，只有确定合理的N、P施肥比例，才能产出优质烟草，同时又不人为地加重病害发生程度。为此，笔者以生态防治为指导思想，从施肥的角度，研究不同N/P比对烟草黑胫病菌生长速率、形态等方面的影响，找出最适于病菌生长的N/P比，从而指导实际生产中合理施肥，并以此来控制烟草黑胫病病害的发生，以减轻烟草种植过程中的损失，提高经济价值。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 仪器显微镜、全自动电热压力蒸汽灭菌箱（YXQ-LS-SⅡ）、立式循环通风干燥箱（101A-2C）、智能人工气候箱（RXZ 106L-A光照度3000）、洁净工作台（SW-OJ-2F）、分析天平等。

1.1.2 器具培养皿、1mL注射器、接种饼、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、棉花、纱布、棉线、酒精灯、接种环、接种针等。

1.1.3 药品硝酸钠、磷酸二氢钾、升汞溶液、酒精、蒸馏水、无菌水、葡萄糖、马铃薯、琼脂等，试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.4 菌种采集凤阳烟草所烟田中典型烟草黑胫病株进行分离纯化得到烟草黑胫病菌。

1.2 试验设计

1.2.1 试验方法采用随机区组设计二因素试验统计方法[3]。

1.2.2 有效含量及各处理设计根据大田实际情况施肥量5～20kg/667m2[4]以及培养皿面积为0.063 585m2（培养皿半径为4.5cm），试验设计以有效含量为0.15g/皿为标准。由于硝酸钠有效含氮量为16.47%，磷酸二氢钾有效含磷量为22.19%，因此有效氮0.910 7g（硝酸钠）=有效磷0.658 7g（磷酸二氢钾）。根据前期预备试验，不断细化配比，处理Ⅰ、Ⅱ加入单纯氮源和单纯磷源以探索单一施肥对病菌生长的影响，并与氮磷配合施肥作比较；中间（处理Ⅲ～Ⅶ）共5个处理按等比数列分别设置N/P比为6∶1、3∶1、3∶2、3∶4、3∶8，探索最适病菌生长比例，最后一个处理设为空白对照，共8个处理，每个处理重复3次。处理质量设计如下：（1）保证天平所造成的测量误差≤±0.1%；（2）因PDA易凝固，所以将试剂制成试液，各组处理试剂均用10mL无菌水水稀释，且均加入10mL培养基，使得实际配置药液稀释2倍；因此，试剂质量依有效含量质量的2倍（即0.30g/皿）来设计称量质量。8个处理试剂质量如下：Ⅰ：1.821 4g硝酸钠；Ⅱ∶1.3162g磷酸二氢钾；Ⅲ∶硝酸钠（1.561 2g）∶磷酸二氢钾（0.188 0g）=6∶1；Ⅳ：硝酸钠（1.366 0g）∶磷酸二氢钾（0.329 0g）=3∶1；Ⅴ：硝酸钠（1.092 8g）∶磷酸二氢钾（0.536 4g）=3∶2；Ⅵ：硝酸钠（1.040 8g）∶磷酸二氢钾（0.752 0g）=3∶4；Ⅶ：硝酸钠（0.496 8g）∶磷酸二氢钾（0.957 2g）=3∶8；Ⅷ：空白对照（ck）。

1.2.3 菌种、接种方法及培养环境（1）菌种：由大田采黑胫病植株，依据其病原形态[5]，分离出病菌，并连续培养，经显微镜观察符合黑胫病病菌病原形态后，利用柯赫式法则检验，最后得纯种。（2）采用直径为0.5cm的接种饼接大小一致的菌饼置于培养基中央。（3）培养基：由于烟草黑胫病为真菌（疫霉属）病害，因此采用PDA培养基。在将培养基倒入培养皿之前，每皿注入3mL试液，而后倒入培养基，及时混匀，即成为试验所需培养基。（4）培养环境：由于烟草疫霉菌喜高温、喜高湿，菌丝生长最适温度为28～32℃，孢子囊产生最适温度为24～28℃，游动孢子活动和发芽的最适温度为20℃，孢子囊在空气相对湿度97%～100%时生长最快，光有抑制孢子囊发芽的作用[6-8]。综合以上所有因素，试验设计培养条件为温度：30℃；湿度：98%；光暗交替：每12h。

1.3 测定项目及分析方法

1.3.1 试验测定项目及测定方法（1）显微镜鉴定纯菌种，并运用柯赫式法则鉴定；（2）十字交叉法测定每个处理的生长直径，每24h测定一次；（3）目测菌丝生长形态：疏密程度，气生菌丝生长情况，菌丝厚薄。

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 黑胫病菌种鉴定由于试验病菌从黑胫病病株上分离纯化而得，因此需鉴定病菌。首先依据烟草黑胫病的病原为卵菌门疫霉属，气生菌丝较细，无色透明，无隔膜，孢子囊顶生或侧生，梨形或椭圆形，顶端有乳头状突起。适宜条件下，可产生3～30个游动孢子。游动孢子无色，侧生两根不等长鞭毛[3，9-10]。将所产生孢子挑出（少量），置于载玻片，于显微镜下观察，找出符合病菌生理形态的菌种。然后将显微镜鉴定的菌种培养纯种，种植健康烟草，运用柯赫式法则回接，依据其症状表现，即茎基部受害后出现黑斑，并环绕全茎向上部延伸，有时病斑可达病株高度的1/3～1/2，病株叶片自下向上依次变黄。由此症状证实试验所用菌种为黑胫病病菌。

1.3.2.2 生长半径依据十字交叉法[11]测得直径为d1、d2，则r=（d1+d2）/2，由于每一个处理有3组重复（r1、r2、r3），最后半径取三者平均数，即r=（r1+r2+r3）/3即得试验所需半径。

1.3.2.3 生长速率生长半径每24h记录一次，记录时均减去菌饼直径0.5cm，设第1天记录的半径为R1，第2天为R2，第3天为R3，因此第一个24h生长速率V1=（R2-R1）/24，第二个24h生长速率为V2=（R3-R2）/24。

1.3.2.4 数据分析通过DPS数据处理系统、方差分析及多重比较法，并找出菌丝密集，且孢子较多等生理形态，找出最适病菌生长的N/P比。

2 结果与分析

2.1 病原及形态黑胫病病菌气生菌丝较细，无色透明，无隔膜，孢子囊顶生或侧生，梨形或椭圆形，顶端有乳头状突起。适宜条件下，可产生3～30个游动孢子。游动孢子无色，侧生两根不等长鞭毛，在水中游动，遇寄主时失去鞭毛，产生牙状管侵入植株，条件不适宜时，孢子囊也能直接萌发出芽管侵入。

2.2 不同N/P比对烟草黑胫病病菌生长速率的影响

2.2.1 不同处理的烟草黑胫病病菌生长情况由表1可以看出，处理Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ菌丝生长较密，且菌丝生长长度较长，菌落形态较厚，处理Ⅱ、Ⅶ菌丝较疏松，菌落形态薄，菌丝长度较短，依据形态及生长所需时间，预估处理Ⅴ为候选最适烟草黑胫病病菌生长的氮磷比。

由图1可以看出，8个处理中：（1）加单纯P和N中，处理Ⅱ（1.316 2g磷酸二氢钾）即加入单纯的磷源，生长最慢，同时也比空白生长慢，长满培养皿所需时间比空白及其他处理的时间长，由此可见单纯施磷肥不会增加病害发生率；单纯给予氮营养时，病菌生长仅比空白慢，较其他处理生长快，由此可见氮肥应与其他肥料配合施用，单独施肥会增加病害发生几率。（2）在N/P二者比例中，处理Ⅴ（N/P=1.5∶1）生长半径以及生长形态较其他处理均为最快，且比空白生长快，初步估计若按此比例施肥会增加病害发生几率；处理Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ生长情况相似，且均比较空白生长慢，预估生产中与这些处理类似的比例施肥会减少病害发生几率。（3）各处理生长形态经比较，可知当N/P比例中，磷多得多时菌丝疏松且孢子很少甚至没有，而氮多得多时，菌丝普遍比较密集，基本上均产孢。

2.2.2 不同处理的烟草黑胫病病菌平均生长速率由图2可知，各处理生长速率由慢至快为：Ⅱ<Ⅵ<Ⅳ<Ⅶ<Ⅷ<Ⅲ<Ⅰ<Ⅴ，即当氮磷肥配合施用时，处理Ⅵ（3∶4）生长速率较慢，处理Ⅴ生长速率最快；结合2.2.1分析，可知烟草黑胫病病菌在高氮低磷情况下生长速率相当快，且菌丝密集，产孢多且快，如处理Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ结合生长形态综合判定使病菌生长最慢比例；当N/P比相差不大或者高磷低氮时，黑胫病病菌生长速率较慢，且菌丝均较短，疏松而产孢少。因此，施肥中氮肥的施肥量一定要把握准确，以免增加病害的发生几率。

3 结论与讨论

3.1 烟草黑胫病病菌最适氮磷比测定结果

3.1.1 单一施肥烟草黑胫病病菌在单纯以磷酸二氢钾为磷源的的培养基上生长速率最慢，长满培养皿所需时间最长，且当其他处理长满时仍未产孢，与其他处理呈显著性差异，但生产中往往不会单施钾肥，若需要单施钾肥，应按处理Ⅱ以计算每667m2施钾肥量；而在以单纯的硝酸钠为氮源的培养基上生长速率仅次于空白和处理Ⅴ，因此在烟草种植过程中，单施硝酸钠等氮肥时，病害发生可能性较大。

3.1.2 最适氮磷比得测定由于实际施肥中是氮、磷肥配合施用，因此重点在于氮磷配比。综合分析可知，处理Ⅴ，即N∶P=3∶2，为最适病原菌生长比例，若按此比例施肥，发生病害可能性较大，因此应避免此种施肥比例。

3.1.3 生产中适宜施肥配比通过以上数据分析可知，处理Ⅳ（3∶1）、Ⅵ（3∶4）、Ⅶ（3∶8）是较单纯施磷源生长较慢的几个配比，结合图1生长形态处理Ⅳ、Ⅵ菌丝生长较处理Ⅶ密集，处理Ⅵ较处理Ⅳ、Ⅶ菌丝长，处理Ⅳ、Ⅵ较处理Ⅶ孢子量多，因此，实际生产中氮磷配比按照与此3个处理接近比例，均可有效的通过合理施肥减小病害发生几率。在实际施肥中，应遵循低氮的原则，少施氮肥，合理施肥，同时配合间作栽培模式，采取“预防为主，防治结合，综合防治”的总体策略，通过加强栽培管理措施，以尽可能减轻烟草黑胫病病害的发生程度。

3.2 实验测定的不足之处试验只选择了硝酸钠、磷酸二氢钾2种药物作为试验营养肥来假设现实中的氮、磷肥，且选择的施用量依南方地区施肥量而定，并不包含病菌生长所需的所有氮、磷源，由于目前较少有文献通过研究N/P比对烟草黑胫病菌的生长状况来指导施肥，控制病害发生，所以N/P比例设计不全面，因而结果有一定的局限性。

3.3 实验的实际意义研究表明，烟草黑胫病发生动态与连作状况、寄主的抗感性及气象因素呈一定的相关性。当前，较多文献在栽培措施方面进行了大量的研究，对控制黑胫病的发生起到了很好的效果，但对施肥比例研究较少。由于目前仍然多采用药剂防治，长期使用化学药剂，不但会对环境造成严重的污染，而且会导致品种的抗病性逐年下降。因此，本试验从栽培时施肥角度，研究不同N/P比与烟草黑胫病菌生长的关系，找出使病菌生长最快的N/P比以及使病菌发展较慢的N/P比，从而在实际生产中对合理施肥起到一定的指导作用，适当控制病害的发生。在今后的工作中，首先，应建立以烤烟为主的轮作制度，尤其是水旱轮作，以减少病原物和侵染源；其次，在栽培耕作时应按照适当比例施肥，将病害发生的可能性降至最低；第三，采用无公害的植物抗逆诱导剂来提高植物抗性，使易感病的优质品种转变为抗病品种；最后，选用少量低毒高效、无残留的农药杀死和抑制病原菌。通过以上措施，可以减少烟叶的农药残留量，生产出无公害烟叶[12]。

参考文献

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