蚤休复方对T N B S诱导炎症性肠病小鼠的治疗作用及其机制研究

王 卯 陈玉根 杨柏霖 王 琼 周锦勇 吴 静

（南京中医药大学附属医院，江苏南京210029）

炎症性肠病 （Inflammatory bowel disease，IBD）是一种病因尚不明确的慢性非特异性肠道炎症性病变，包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）。近年来，IBD发病率呈上升趋势，大部分IBD患者需终身治疗，而临床主要治疗药物如糖皮质激素、氨基水杨酸、免疫抑制剂和抗肿瘤坏死因子抗体副作用较多，多数患者不能长期坚持治疗，导致疾病复发和进展[1-2]。因此，开发安全有效的IBD新药具有重要意义。国医大师徐景藩教授是学贯中西的临床大家，他充分了解炎症性肠病发病机制及病程，在辨证论治的基础上，对于病程较长，反复腹痛、腹泻、发热，反复出现肠梗阻等并发症，以及肠镜提示肠腔狭窄的病例每多选用蚤休、青蒿、鸭跖草、紫草、露蜂房、白芷、地锦草等药，取得了较好的疗效。本研究总结徐景藩教授治疗炎症性肠病经验方蚤休复方，利用三硝基苯碳酸（TNBS）诱导建立小鼠IBD模型，采用临床治疗IBD常规用药柳氮磺吡啶作为对照，研究蚤休复方对炎症性肠病的治疗作用及其作用机制。

1 实验材料

1.1 药物与试剂 蚤休复方提取物 （蚤休∶青蒿∶鸭跖草∶紫草∶地锦草∶露蜂房∶白芷=2∶3∶6∶3∶3∶2∶2）由江苏省中医院制剂部提供。将所有药材 （15剂，约1600g）加入约10倍量水中浸润30min，分2次水煮提取。第1次煮沸后在微沸状态下煎煮60min，过滤得滤液；剩余药渣再次加入10倍量水微沸状态下煎煮40min，过滤得滤液；合并2次滤液，加热浓缩至体积约1500mL，得浓度为1g生药/mL的浓缩水提物，分装，4℃条件下保存待用。三硝基苯磺酸（Picrylsulfonic acid solution，TNBS），SIGMA 公 司 ；柳氮磺吡啶，上海中西三维药业有限公司；便隐血（OB）试剂盒，珠海贝索生物技术有限公司；MILLIPLEXRMAP的小鼠细胞因子/趋化因子磁珠试剂盒，美国Millipore公司。

1.2 实验动物 BALB/c小鼠80只，18～22g，雌雄各半，由扬州大学比较医学中心提供，动物合格证号：SCXK（苏）2012-0004。

1.3 实验仪器 MAGPIX多重磁珠酶免分析平台，美国Millipore公司。

2 实验方法

2.1 小鼠实验分组及模型建立 80只小鼠随机分为4组（n=20）：正常对照组、模型组、柳氮磺吡啶组和蚤休复方组。正常对照组不造模，正常饲养。模型组、柳氮磺吡啶组、蚤休复方组小鼠参照文献[3]方法，于实验前剃毛，皮肤外涂TNBS 3.75mg（48%乙醇溶解），分别于外涂TNBS后的第7、14、21天直肠给予 TNBS 0.75mg、1.5mg、2.25mg（40%乙醇溶解），诱导IBD小鼠模型。

2.2 药物干预 药物干预与造模同时进行。蚤休复方组给予10g/kg蚤休复方提取物灌胃，柳氮磺吡啶组给予0.5g/kg柳氮磺吡啶灌胃，正常对照组和模型组给予等量生理盐水，每日1次，连续灌胃给药28d。

2.3 观察指标 每日记录小鼠体重、粪便性状、便隐血，参考文献[4]方法，对小鼠进行疾病活动指数（DAI）评分，并记录死亡情况。实验结束时处死小鼠，取结直肠称重，测量长度和重量。取结直肠组织进行结肠炎症病理评分，随后10%福尔马林固定，常规取材，脱水，石蜡包埋，切片经苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜观察，参考文献评判标准进行结肠炎症组织病理学评分[5]。小鼠取血，利用多水平自动化和高通量的磁珠法筛选，即以MILLIPLEXR MAP的小鼠细胞因子/趋化因子磁珠试剂盒定量检测32种细胞因子和趋化因子。

2.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组小鼠存活率比较 正常对照组小鼠实验过程中未出现死亡，存活率为100%；模型组小鼠终点生存率为70%，与正常对照组比较具有统计学差异（P=0.02683）；柳氮磺吡啶组及蚤休复方组小鼠终点生存率均较模型组高，但差异均无统计学意义。见表1。

表1 各组小鼠存活率比较

3.2 各组小鼠结肠重量/长度比值比较 TNBS诱导的IBD模型小鼠结肠重量/长度的比值升高，与正常对照组比较有显著性差异（P＜0.01）；柳氮磺吡啶能显著降低IBD模型小鼠升高的结肠重量/长度比值（P＜0.01）；蚤休复方组结肠重量/长度比值较模型组降低，但差异无统计学意义。见表2。

表2 各组小鼠结肠重量/长度比值比较

3.3 各组小鼠疾病活动指数比较 TNBS诱导的IBD模型小鼠DAI指数较正常对照组明显升高（P＜0.01）；柳氮磺吡啶和蚤休复方组小鼠DAI指数显著低于模型组（P＜0.01，P＜0.05）。见表 3。

表3 各组小鼠疾病活动指数比较

3.4 各组小鼠结肠病变情况及病理评分比较 如图1所示，正常对照组小鼠结肠未见明显病变；模型组小鼠结肠炎症严重程度为轻度或中度，多数累及黏膜层和黏膜下层，个别累及肌层，多数见隐窝损害；柳氮磺吡啶组结肠炎症严重程度较模型组明显减轻，病变均局限于黏膜层，无隐窝损害；蚤休复方组结肠炎症较模型组减轻，炎细胞类型同前，病变均局限于黏膜层，均无隐窝损害。病理评分结果见表4。与正常对照组比较，模型组小鼠病理评分明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，柳氮磺吡啶组和蚤休复方组小鼠病理评分均明显降低（P＜0.01，P＜0.05）。

图1 各组小鼠结肠病理图片（HE染色，×200）

表4 各组小鼠病理评分比较 分

3.5 各组小鼠细胞因子血清水平比较 检测了32种细胞因子和趋化因子，与模型组比较，蚤休复方组小鼠血清IL-12 P70明显增加 （P=0.030），CCR5配体 MIP-1ɑ明显减少（P=0.045），而 CXCR3配体CXCL9（MIG）、CXCL10（IP-10）血清水平显著增加（P=0.006，P=0.027）。

表5 各组小鼠IL-12 P70、IP-10、MIP-1ɑ及MIG表达水平比较

4 讨论

目前炎症性肠病的发病原因及机制尚不明确，一般认为可能与免疫、感染、环境、遗传等多种因素相关。西医治疗IBD以控制炎症、缓解症状为主，多采用氨基水杨酸类药物，如柳氮磺吡啶，主要有效成分为5-氨基水杨酸，与肠壁结缔组织络合后较长时间停留在肠壁组织中起到抗菌消炎和免疫抑制作用，同时抑制前列腺素的合成以及其他炎症介质白三烯的合成。此法有一定疗效，但不良反应较大，复发率高。

徐景藩教授认为，炎症性肠病的主要病因病机为“热毒”。湿热蕴结肠腑，久而化火酿毒，阻滞气血，不通则痛；热毒壅盛，肉腐成脓，内溃成疡；入营动血，迫血妄行，下痢脓血。在辨证论治的基础上，徐老多选用蚤休、鸭跖草、紫草清热凉血解毒，青蒿、地锦草清热利湿，露蜂房攻毒止痛，白芷燥湿排脓，诸药共奏清热解毒、利湿敛疡之效。

TNBS诱导以免疫介导的肠道炎症模型，引起的免疫应答以Th1为主，病变特点与炎症性肠病类似[6]。本研究采用TNBS诱导小鼠IBD模型，动物存活率70%，可满足研究需要。模型小鼠结肠重量/长度的比值、疾病活动指数以及病理评分均升高，与正常对照组比较有显著性差异（P＜0.01），表明TNBS诱导的IBD模型较好地体现了IBD从急性炎症向慢性炎症转化的动态过程，适用于IBD中药复方的药效学评价。与模型组相比，蚤休复方组小鼠存活率增高，IBD疾病活动指数明显降低，结肠重量/长度比值降低，结肠病理评分明显降低，小鼠结直肠炎症水肿改善，结肠组织炎症和隐窝损害明显减轻降低。上述结果共同提示蚤休复方提取物能减轻TNBS诱导的小鼠炎症性肠病症状，具有较好的治疗作用。

免疫因素，尤其是肠道免疫系统的调节异常，是IBD非常重要的发病原因及机制之一，细胞因子在机体免疫应答中具有重要作用。本研究检测了小鼠多种主要细胞因子含量的变化，结果发现与模型组相比，蚤休复方组小鼠CCR5配体MIP-1ɑ明显减少（P=0.045），而 CXCR3 配体 CXCL9（MIG）、CXCL10（IP-10）的血清水平显著增加（P=0.006，P=0.027）。有研究表明，MIP-1ɑ增加会加重BALB/c实验小鼠的结肠炎，其会显著增加小鼠发生穿透性溃疡的风险[7]。Toll样受体（TLR）与炎症性肠病密切相关，特别是TLR3和TLR4。TLR一旦识别并结合PAMP（病原相关分子模式，如LPS）就会导致下游信号事件和转录因子的协调激活，从而诱导抗微生物、化学趋化因子、细胞因子和共刺激因子的表达。TLR4与干扰素协同，调节趋化因子的生成，如MIG[8]。通过与其受体CXCR3结合，MIG吸引CD4+和CD8+T细胞，并激发宿主的炎症反应。有研究提出，激活TLR通路可缓解炎症性肠病小鼠肠道炎症[9]。亦有研究发现，静脉应用TLR配体既可呈现促炎作用，也可呈现抗炎作用，这取决于何种配体处于优势水平[10]。TLR4激动剂可刺激大量产生IP-10。IP-10是不同细胞对IFN-γ、微生物成分应答后产生的CXC化学激活因子，可对单核细胞、NK细胞产生化学吸附作用，更重要的是Th1型细胞优先表达IP-10受体CXCR3[11]。TLR4的活化促进炎症前介质的释放，有助于白细胞的迁移浸润，激活天然免疫和获得性免疫系统，增强组织纤维化[12]。本项研究结果提示，蚤休复方中单体成分可能与IFN-γ协同刺激巨噬细胞产生CXCL9（MIG）、CXCL10（IP-10）等因子，进而影响 T 细胞活化、趋化，具有类TLR4激动剂作用。蚤休复方调节免疫应答的具体分子机制及活性单体成分有待进一步研究。

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