4种云南野生牛肝菌的多酚含量及其抗氧化活性*

徐胜平，刘雨阳，吴素蕊，曹建新**，陈正启

（1．昆明理工大学云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500；2．中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221）

4种云南野生牛肝菌的多酚含量及其抗氧化活性*

徐胜平1，刘雨阳1，吴素蕊2，曹建新1**，陈正启2

（1．昆明理工大学云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500；2．中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221）

从铜色牛肝菌（Boletus aereus）、双色牛肝菌（B.bicolor）、美味牛肝菌（B.edulis）、灰褐牛肝菌（B. griseus）4种云南野生牛肝菌中提取多酚物质，研究了所得多酚组成及其抗氧化作用。结果表明：铜色牛肝菌、双色牛肝菌、美味牛肝菌和灰褐牛肝菌所含多酚类物质的种类和含量存在差异，在10种酚类物质中，5-磺基水杨酸、儿茶素和肉桂酸在4种牛肝菌中均被检出。其中5-磺基水杨酸含量最高，在4种牛肝菌中的含量分别为986．88 mg/100g、679．00 mg/100g、1 369．25 mg/100g、1 268．5 mg/100g。4种牛肝菌多酚对DPPH自由基、ABTS自由基和羟自由基都具有很好的清除能力，且该清除能力与多酚浓度呈现出很好的剂量相关性。4种牛肝菌都具有很好的铁离子还原能力，IC50值介于0．02和0．04之间。

牛肝菌；多酚；抗氧化活性

牛肝菌属真菌门（Eumycota）担子菌亚门（Basidiomycotina） 层菌纲 （Hymenomycetes） 伞菌目（Agaricales） 牛肝菌科（Boletaceae） 牛肝菌属（Boletus）[1]。牛肝菌在意大利、法国、瑞士、德国尤被推崇，在我国分布广泛，西南地区最多[2]。牛肝菌具有较强的抗氧化性[3]，能抑制癌细胞[4]、降血压[5]和降血脂等[6]。抗氧化性是多酚普遍存在的一种活性，活性氧增多可导致体内脂质过氧化、衰老，甚至引发心脏病[7-8]。酚类结构使其对活性氧等自由基具有很强的捕捉能力，能够减少或阻止氧化反应的发生[9]。近年来，新型天然抗氧化剂的开发与利用逐渐受到人们的关注和重视[10]。

本实验选取采自云南省的铜色牛肝菌（Boletus aereus）、双色牛肝菌（B.bicolor Peck）、美味牛肝菌（B.edulis）和灰褐牛肝菌（B.griseus）4种野生牛肝菌，对其所含多酚类物质进行提取，测定含量及组成，并对体外抗氧化作用进行了探究，以期进一步拓展4种食用菌的利用价值，为开发新型的天然抗氧化剂提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜铜色牛肝菌、双色牛肝菌、美味牛肝菌、灰褐牛肝菌，均购自昆明木水花野生菌交易市场。

Na2CO3、福林酚、没食子酸、乙酸、甲醇、乙醇、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-联氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸） 二氨盐（ABTS）、过硫酸钾、Na2HPO4、NaH2PO4、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、水杨酸、硫酸亚铁和过氧化氢等均为分析纯；乙腈，HPLC级，为德国Merck KGaA公司产品；5-磺基水杨酸、没食子酸、槲皮素、苯甲酸、儿茶素、咖啡酸、芦丁、绿原酸、原儿茶酸、肉桂酸，均≥99%，为Sigma公司产品。

1.2 仪器与设备

ZD-F12真空冷冻干燥机，购自南京载智自动化设备有限公司；AL204型分析天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；HH-4恒温水浴锅，金坛市科析仪器有限公司；YHZ82恒温振荡器，常州国华电器有限公司；L500台式低速自动平衡离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；FE20实验室pH计，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；溶剂过滤器和0．45μm微孔滤膜，天津津腾试验设备有限公司；1260高效液相色谱仪，Agilent，Germany；Spectra-Max M5多功能酶标仪 Molecular Devices，America；生物显微镜，重庆澳浦光电技术有限公司。

1.3 方法

1．3．1 牛肝菌多酚的提取工艺流程图

将铜色牛肝菌、双色牛肝菌、美味牛肝菌、灰褐牛肝菌子实体冻干后打磨成粉，过80目筛，准确称取5 g粉末放入250 mL锥形瓶中，加入100 mL 60%乙醇，置于60℃恒温水浴锅中，提取1 h，然后将提取液经6层纱布过滤，5 000 r·min-1离心10 min[11]，提取2次合并滤液即为多酚提取液，4℃保存备用。

1．3．2 牛肝菌多酚含量测定

多酚含量的测定采用Folin-ciocalteu方法，并经过一些修改进行测定[12]。

1．3．3 HPLC法测定多酚的种类

样品配制：分别提取4种牛肝菌中多酚类物质，55℃真空浓缩至膏状，加少量水将提取物溶出后定容，测定提取物中多酚类物质含量。进样前过滤，备用。

参照Liang等[13]的方法并适当修改：色谱柱：Agilent C18（4．6 mm×250 mm，5 μm）；紫外检测波长280 nm，柱温25℃，进样量10 μL，流速为1 mL·min-1，流动相A为0．2%乙酸溶液，流动相B为100%乙腈溶液。梯度洗脱程序：0～2 min，10%B；2 min～31 min，10%～40%B；31 min～40 min，40%～90%B；40 min～41 min，100%B。

1．3．4 牛肝菌多酚类物质体外抗氧化作用

（1）DPPH自由基清除活性

将0．4 mL不同浓度的多酚溶液分别加入2．0 mL 0．1 mmol·L-1DPPH甲醇溶液，混合均匀后避光反应30 min，517 nm处测定吸光值AX。同时以同体积甲醇和超纯水分别取代DPPH溶液和多酚样品调零，以同体积的超纯水代替多酚溶液作为空白对照组，测吸光值A0，以同体积甲醇代替DPPH作为样品对照组，测吸光值AX0。DPPH自由基清除率（C1）公式为：

（2）ABTS自由基清除活性

取0．5 mL不同浓度的牛肝菌多酚，分别加入4 mL ABTS＋反应液（0．0025 g/100mL甲醇），振荡摇匀后于30℃水浴中静置6 min，测定734 nm下的吸光值AX。同时以同体积乙醇和超纯水分别取代ABTS＋溶液和多酚样品调零，以同体积的乙醇代替多酚溶液作为空白对照组，测吸光值A0，以同体积乙醇代替 ABTS＋溶液作为样品对照组，测吸光值AX0。ABTS自由基清除率（C2）公式为：

（3）羟基自由基清除活性

取1mL不同浓度的牛肝菌多酚溶液依次加入0．3 mL 8．0 mmol·L-1FeSO4、0．25 mL 20 mmol·L-1H2O2，震荡摇匀静置10 min，加入1 mL 3．0 mmol·L-1水杨酸乙醇溶液摇匀，于37℃水浴30 min，取出后流水冷却至室温，6 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液在510 nm处测吸光值AX。以等体积超纯水代替样品作为空白对照组测吸光值A0，以等体积超纯水代替水杨酸作为样品对照组，测吸光值AX0，以等体积超纯水分别代替多酚样品和水杨酸调零。羟基自由基清除率（C3）公式为：

（4）铁离子还原能力（铁氰化钾）

将4种牛肝菌粗多酚配成不同浓度的溶液备用。在离心管中依次加入1 mL 0．2 mol·L-1pH6．6的磷酸缓冲液、1 mL不同浓度的多酚溶液、1 mL 1%铁氰化钾溶液，于50℃水浴20 min；再加入1 mL质量浓度10%三氯乙酸，流水冷却，5 000 r·min-1离心10 min，取上清液1 mL；再加入1 mL超纯水和0．2 mL质量浓度0．1%的三氯化铁，反应10 min后于700 nm处测其吸光值。以等体积超纯水代替多酚样品调零。

1.4 数据处理

数据采用Origin 8．5统计分析，试验重复3次，结果用x±s表示，并用SPSS 19．0软件进行统计处理。

2 结果与分析

2.1 4种牛肝菌中多酚含量

以没食子酸为标准对照，采用福林酚方法获得标准曲线，方程为y=0．00628x＋0．02369，R2=0．9998，由此计算出铜色牛肝菌、双色牛肝菌、美味牛肝菌、灰褐牛肝菌的总酚含量分别是（5．34±0．04）%、（3．64±0．04）%、（2．01±0．01）%、（4．02±0．03）%；总酚含量的顺序为铜色牛肝菌＞灰褐牛肝菌＞双色牛肝菌＞美味牛肝菌。

2.2 牛肝菌中10种多酚的含量

在1．3．3所述色谱条件下，分别将铜色牛肝菌、双色牛肝菌、美味牛肝菌和灰褐牛肝菌4种样品进样，测定10种多酚类物质的含量，各成分的含量以毫克等量每100克牛肝菌干重（mg/100g） 来表示，测定结果见表1。

表1 4种云南野生牛肝菌样品的多酚类物质含量Tab．1 The polyphenol content of four kinds of Yunnan wild Boletus samples

由表1可见，不同牛肝菌中各种多酚含量有所差异。在该色谱条件下测定铜色牛肝菌、双色牛肝菌、美味牛肝菌、灰褐牛肝菌4种样品，均检测出5-磺基水杨酸、儿茶素和肉桂酸，且5-磺基水杨酸在所检测的10种酚类物质中含量最高。另外，在铜色牛肝菌中还检测出没食子酸、苯甲酸、咖啡酸、芦丁和原儿茶酸等共8种多酚类物质；在双色牛肝菌中还检测出没食子酸、槲皮素、苯甲酸、绿原酸和原儿茶酸等共8种多酚类物质；在美味牛肝菌中还检测出咖啡酸等共4种多酚类物质；在灰褐牛肝菌中还检测出咖啡酸、芦丁和绿原酸等共6种多酚类物质。

在此色谱条件下，10种酚类物质得到了较好地分离，说明该色谱条件适合测定牛肝菌中5-磺基水杨酸、没食子酸、槲皮素、肉桂酸等多酚类物质。铜色牛肝菌、双色牛肝菌、美味牛肝菌、灰褐牛肝菌中所含多酚类物质的种类和含量均存在差异，在10种多酚类物质中，5-磺基水杨酸、儿茶素和肉桂酸在4种牛肝菌中均被检出。其中5-磺基水杨酸含量最高，分别为986．88 mg/100g、679．00 mg/100g、

1 369．25 mg/100g、1 268．5 mg/100g。

2.3 云南野生牛肝菌多酚的抗氧化活性

2．3．1 DPPH自由基清除活性

4种云南野生牛肝菌中多酚的DPPH自由基清除能力见图1。

图1 不同浓度牛肝菌多酚的DPPH自由基清除能力Fig．1 Dose-dependent DPPH free radical scavenging ability of Boletus polyphenols

由图1可见，4种牛肝菌多酚都表现出很好的DPPH自由基清除活性，且随着提取物多酚浓度的增加清除率也有所增加，说明云南野生牛肝菌中的多酚是一类与其表现出的抗氧化性有重要关系的化合物。实验结果表明，对于同一种牛肝菌多酚，DPPH自由基清除能力与多酚含量呈现出很好的正相关（R2=0．9949）。

在4种牛肝菌中，铜色牛肝菌对DPPH自由基的清除能力最强，当浓度达到0．35 mg·mL-1时清除率达到79．96%。DPPH自由基的清除能力顺序为：铜色牛肝菌＞双色牛肝菌＞美味牛肝菌＞灰褐牛肝菌。

不同品种的牛肝菌对DPPH自由基的清除能力不同，这是因为多酚类化合物清除DPPH自由基的能力大小受多种因素的共同控制。范金波等[14]研究表明，多酚的DPPH自由基清除活性与酚酸的构成有关，相同浓度的咖啡酸与芦丁对DPPH自由基的清除能力相当，均显著高于原儿茶酸的活性；Vignoli等[15]研究表明，咖啡饮料中酚酸的含量与DPPH自由基清除能力呈极显著的正相关性。

2．3．2 ABTS自由基清除活性

4种云南野生牛肝菌多酚的ABTS自由基清除能力结果见图2。

图2 不同浓度牛肝菌多酚的ABTS自由基清除能力Fig．2 Dose-dependent ABTS free radical scavenging ability of Boletus polyphenols

由图2可见，各样品均具有较强的ABTS自由基清除能力，大小顺序依次为铜色牛肝菌＞美味牛肝菌＞双色牛肝菌＞灰褐牛肝菌。表明ABTS自由基清除能力与牛肝菌乙醇提取物中多酚含量呈现出很好的正相关（R2=0．9880）。其中当铜色牛肝菌多酚浓度为0．5 mg·mL-1时，对ABTS自由基清除率高达92．31%。4种牛肝菌对DPPH和ABTS自由基清除能力有所不同，实验结果的差异可能是由于氧化体系不同所致。此前，Wootton-Beard等[16]通过比较23种果蔬饮料对DPPH和ABTS自由基清除能力，发现二者相关性较低（R2=0．45）。

2．3．3 羟基自由基清除活性

云南野生牛肝菌多酚的羟基自由基清除能力结果见图3。

由图3可见，4种牛肝菌对羟自由基清除能力很强，且清除能力与多酚含量呈剂量正相关性。随着多酚含量的增加，羟自由基清除能力逐渐增强，当多酚浓度为0．2 mg·mL-1时，双色牛肝菌对其清除率已经达到86．59%。4种野生菌对羟自由基清除能力效果最好的是双色牛肝菌，最差的是灰褐牛肝菌。

图3 不同浓度牛肝菌多酚的羟自由基清除能力Fig．3 Dose-dependent hydroxyl radical scavenging ability of Boletus polyphenols

多酚对自由基的清除活性受多种因素共同控制。在不同抗氧化体系中，其抗氧化能力的表现也不尽相同。Hou等[17]报道，自由基清除活性与分子中羟基的位置有关；Huang等[18]研究表明，生物系统中的代谢产物和pH范围均可影响多酚类化合物的结构，进而影响其抗氧化活性。

2．3．4 铁离子还原能力（FRAP）

4种云南野生牛肝菌多酚铁离子还原能力结果见图4。

由图4可见，可以看出随着多酚浓度的增加，吸光值逐渐加大，说明牛肝菌多酚对铁离子的还原能力逐渐增大，以此表明抗氧化能力的增强。当多酚浓度为0．02 mg·mL-1时，铜色牛肝菌、双色牛肝菌、美味牛肝菌、灰褐牛肝菌的700 nm下的吸光值分别为0．379、0．280、0．350和0．539。

在还原力方面，美味牛肝菌相比双色牛肝菌对铁离子还原能力相近但略高，均低于铜色牛肝菌及灰褐牛肝菌。Karaman等[19]研究表明多酚可以作为氧自由基清除剂、还原剂以及氢原子供体，甚至有的多酚类物质还能够螯合金属离子。牛肝菌多酚的强还原力无疑为其作为还原剂中的一种有效成分提供可行性参考。

图4 不同浓度牛肝菌多酚的铁离子还原能力Fig．4 Dose-dependent ferric reducing ability of Boletus polyphenols

3 结论

通过福林酚方法测定发现4种牛肝菌中多酚含量存在较大的差异。铜色牛肝菌、双色牛肝菌、美味牛肝菌、灰褐牛肝菌中所含多酚类物质的种类和含量存在差异，在10种多酚类物质中，5-磺基水杨酸、儿茶素和肉桂酸在4种牛肝菌中均被检出，其中5-磺基水杨酸含量最高，分别为986．88 mg/100g、679．00 mg/100g、1 369．25 mg/100g、1 268．5 mg/100g。体外抗氧化实验结果表明，4种云南野生牛肝菌多酚对DPPH自由基、ABTS自由基和羟自由基都具有很好的清除能力，且该清除能力与多酚浓度呈现出很好的剂量相关性。4种牛肝菌都具有很好的铁离子还原能力，IC50值介于0．02和0．04之间。牛肝菌在4种体系中抗氧化能力不完全一致，实验结果的差异可能是由于抗氧化体系不同所致，总的来说，在4种牛肝菌中，铜色牛肝菌多酚抗氧化活性最好，灰褐牛肝菌相对其他牛肝菌抗氧化活性较差。

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云南牛肝菌出口贸易迎来新机遇

据悉，云南省野生牛肝菌出口量约占我国牛肝菌出口总量的80%，是云南省传统大宗出口农产品之一。为持续推动牛肝菌产业发展，促进云南高原特色农产品扩大出口，日前，云南检验检疫局结合质检职能，立足产业实际，落实好国务院提出的简政放权、职能转变以及国家质检总局有关稳定和促进地方外贸经济发展的要求，大胆改革，积极帮扶助推云南牛肝菌扩大出口。该局创新检验监管模式，在风险分析的基础上，结合产品类别、日常检验检疫情况、出口国家检验检疫要求以及企业的诚信建设等情况对出口企业进行分类管理。对工艺成熟的牛肝菌速冻品、盐渍品按20%比例抽检，未抽检的则采信第三方实验室或企业实验室检测结果。

一系列有力措施使云南牛肝菌出口逆市上扬，目前新产季原料大丰收，原料收购价格只有往年的二分之一，令牛肝菌出口贸易又迎来一次新机遇。

中国食用菌商务网 2015.10.30

Polyphenol Content and Antioxidant Activity of Four Kinds of Yunnan Wild Boletus

XU Sheng-ping1,LIU Yu-yang1,WU Su-rui2,CAO Jian-xin1,CHEN Zheng-qi2
(1．Yunnan Institute of Food Safety,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China;
2．Kunming Edible Fungi Institute of All China Federation of Supply and Marketing Cooperatives,Kunming 650221,China)

The polyphenol composition and antioxidant activity of four kinds of Yunnan wild Boletus(B.aereus,B.bicolor Peck,B.edulis and B.griseus) were investigated in the present work．The results showed that the type and content of polyphenols were difference in those four Boletus．Among 10 kinds of polyphenols,5-sulfosalicylic acid,catechin and cinnamon were all detected,and 5-sulfosalicylic acid showed the highest content with 986．88 mg/100g,679．00 mg/100g,1 369．25 mg/100g, 1 268．5 mg/100g,respectively．Polyphenol of four Boletus showed better dose-dependent DPPH,ABTS and hydroxyl free radi cal scavenging ability．Ferric reducing ability of wild Boletus lies between 0．02 and 0．04．

Boletus;polyphenol;constitution;antioxidant activity

S646.9

A

1003-8310（2015）06-0054-06

10．13629/j．cnki．53-1054．2015．06．014

“十二五”国家科技支撑计划课题（2013BAD16B01）。

徐胜平（1987-），男，在读硕士研究生，主要研究方向为功能食品研究。E-mail:742697822@qq．com

**通信作者：曹建新（1969-），女，博士，教授，主要从事食品科学研究。E-mail:jxcao321@hotmail．com

2015-09-08