裂蹄针层孔菌发酵菌丝体对人肝癌HepG-2细胞的抑制作用*

张文隽，吴亚召，雷 萍**，谢艳华，杜 芳

（1．陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043；2．第四军医大学，陕西 西安 710032）

裂蹄针层孔菌发酵菌丝体对人肝癌HepG-2细胞的抑制作用*

张文隽1，吴亚召1，雷 萍1**，谢艳华2，杜 芳1

（1．陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043；2．第四军医大学，陕西 西安 710032）

研究了裂蹄针层孔菌（Phellinus linteus）发酵菌丝体对人肝癌HepG-2细胞的抑制作用。采用MTT比色法测定不同浓度发酵菌丝体对肝癌细胞存活率的影响；建立荷瘤HepG-2裸鼠模型，检测不同剂量裂蹄针层孔菌发酵菌丝体对肿瘤的抑制作用。MTT法观察结果显示，裂蹄针层孔菌发酵菌丝体可抑制人肝癌HepG-2细胞的增殖，且呈现剂量效应关系，高剂量（960 mg·L-1）能显著抑制肿瘤细胞的增殖，最佳抑制时间为24 h；裂蹄针层孔菌发酵菌丝体中剂量（500 mg/kg·d）、高剂量（1 000 mg/kg·d）对荷瘤HepG-2裸鼠有显著的抑瘤作用，抑瘤率分别为40．42%、35．06%。裂蹄针层孔菌发酵菌丝体对人肝癌HepG-2肿瘤细胞有较好的抑制作用。

裂蹄针层孔菌；发酵菌丝体；肝癌HepG-2；抑瘤作用

裂蹄针层孔菌（Phellinus linteus），又名裂蹄木层孔菌、针裂蹄、裂蹄木层孔，俗称桑黄，属担子菌亚门（Basidiomycotina）层菌纲（Hymenomycetes）非褶菌目 （Aphyllophorales） 锈革孔菌科 （Hymenochaeyaceae） 针层孔菌属（Phellinus）[1]。《本草纲目》中有记载桑黄能“利五脏、宣肠胃气、排毒气”[2]。现代医学研究发现其化学成分复杂，含有多糖、黄酮、甾醇类、落叶松蕈酸等活性成分，具有显著的抑制肿瘤以及提高机体免疫能力的作用[3-4]，已经成为药用真菌抗肿瘤研究的热点。

肝癌是我国高发的恶性肿瘤，其死亡率仅次于肺癌，居我国癌症患者死亡的第二位。最近的研究揭示裂蹄针层孔菌和现有化疗药物共同作用时，具有增强化疗药物药效的作用[5]，引起了国内外学者的广泛关注。目前，也有一些文献报道裂蹄针层孔菌菌丝体有一定抑瘤作用，且菌丝体可通过发酵工程大规模生产，克服子实体资源匮乏的缺点。本次试验通过研究裂蹄针层孔菌发酵菌丝体对人肝癌HepG-2细胞的抑制作用，以期为该真菌治疗肝癌的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与细胞株

裸鼠40只，雌雄各半，4周～5周，体重在18 g～22 g，由第四军医大学动物实验中心提供。

人肝癌HepG-2细胞株，由第四军医大学药物研究所细胞室提供。

1.2 试验药物

裂蹄针层孔菌发酵菌丝体：陕西省微生物研究所第三研究室，批号20130102。

顺铂：南京制药公司，批号20120204。

1.3 主要仪器与试剂

SW-CJ-1F医用型洁净工作台，苏州惠丰净化设备有限公司；Thermo Scientific 8000型CO2培养箱，Thermo Fisher公司；Coic生物显微镜，南京冀飞科技有限公司；L420台式低速自动平衡离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；DHG-9701A型电热恒温干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；高压灭菌箱，北京勤诚盛达科学仪器有限公司；微量进样器，Bio-Rad公司；细胞计数板，西安舟鼎国公司；Hy-Clone改良型RPMI-1640培养基，赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；双抗：青霉素及链霉素溶液，北京索莱宝科技有限公司；噻唑兰，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；胎牛血清，赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；二甲基亚砜（DMSO），北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；无水乙醇，天津天力化学试剂有限公司；生理盐水，晨欣制药有限公司。

1.4 方法

1．4．1 细胞培养

取肝癌细胞HepG-2接种于改良型RPMI-1640（含10%胎牛血清、青霉素和链霉素各100 U·mL-1）培养基中，于37℃、5%CO2浓度的培养箱中培养。1．4．2 MTT法检测裂蹄针层孔菌发酵菌丝体对肝癌HepG-2细胞增殖的影响

将细胞铺于96孔板中，每组铺3个板。裂蹄针层孔菌发酵菌丝体浓度设置为960 mg·L-1、480 mg·L-1、240 mg·L-1、120 mg·L-1、60 mg·L-1、30 mg·L-1、顺铂阳性对照组（DDP） 和空白阴性组（blank group）；加MTT以及DMSO分别测12 h、24 h、48 h细胞存活率，得出每个浓度及阳性对照组的抑制率，根据抑制率判断药物的抑制作用。抑制率为正值则说明药物有作用，反之则无效。再分析各浓度的抑制率，得出裂蹄针层孔菌发酵菌丝体的最佳抑制浓度，确定该细胞的敏感浓度及时间[6]。抑制率（P）计算公式为：

式中：OD实验表示实验组OD值；OD空白表示空白组OD值。

1．4．3 裂蹄针层孔菌发酵菌丝体对荷瘤裸鼠肿瘤生长抑瘤试验

（1）荷瘤HepG-2裸鼠模型的建立

取裸鼠40只，在其腹部皮下接种瘤细胞液0．2 mL（细胞浓度为1×104个·L-1），注射局部出现明显皮丘疹，饲养于IVC动物净化装置内。

（2）分组

观察接种裸鼠接种部位肿瘤长出情况，待结节出现，进行分组，每组样本数为8。设置模型组（Model）、阳性对照组（DDP组，顺铂，3 mg/kg·d）、给药组共三大类。其中，给药组又分高剂量组（SHJⅢ，1 000 mg/kg·d）、中剂量组 （SHJII，500 mg/kg·d）、低剂量组（SHJI，250 mg/kg·d）。

高、中、低剂量组样品均溶于生理盐水后，进行灌胃给药（裂蹄针层孔菌发酵菌丝体）；阳性对照组溶于等体积生理盐水同时腹腔给药；模型组给予等体积生理盐水并进行灌胃给药[7]。

（3）组织处理

连续给药7 d，次日处死。无菌环境下取肿瘤组织，去血污称重，计算抑瘤率。抑瘤率（I）计算公式为：

式中：M1表示对照组平均瘤重；M2表示试验组平均瘤重。

（4）统计学处理

用SPSS12．0统计软件以t检验法进行统计学处理，所得数据均以x±s表示。

2 结果与分析

2.1 裂蹄针层孔菌发酵菌丝体对肝癌HepG-2细胞增殖的影响

采用MTT法测定其OD值，统计结果见表1，其中吸光度越小表示活细胞越少。

由表1可见，随着浓度的增加，裂蹄针层孔菌发酵菌丝体表现出对肝癌HepG-2细胞增殖的抑制作用（P＜0．05），且这种抑制作用呈现剂量效应关系，高剂量（960 mg·L-1）能显著抑制肿瘤细胞的增殖。

由MTT实验结果所测OD值计算抑制率（IR），结果如图1所示。

图1 裂蹄针层孔菌发酵菌丝体对肝癌HepG-2细胞的抑制作用Fig．1 Inhibition effect of Phellinus linteus mycelium on the liver cancer HepG-2

图1中抑制率（IR）为正值时说明药物有作用，反之则无效。从图1可以看出，当药物浓度为960 mg·L-1作用24 h时，抑制率最大，即对肝癌HepG-2细胞的抑制率最高。因此裂蹄针层孔菌发酵菌丝体对肝癌HepG-2细胞的最佳抑制时间是24 h。

2.2 蹄针层孔菌发酵菌丝体对荷瘤HepG-2裸鼠肿瘤生长抑瘤试验

蹄针层孔菌发酵菌丝体对荷瘤HepG-2裸鼠肿瘤生长的影响见表2。

从表2可以看出，裂蹄针层孔菌发酵菌丝体对荷瘤HepG-2裸鼠肿瘤生长有一定的抑制作用，给药组的平均瘤重明显小于对照组，3个剂量组的抑瘤率分别为15．24%、40．42%、35．06%，中剂量（500 mg/kg·d）抑瘤效果最好。

表2 蹄针层孔菌发酵菌丝体对荷HepG-2瘤裸小鼠肿瘤生长的影响（n=8）Tab．2 Effect of Phellinus linteus mycelium on the growth of HepG-2 tumor(n=8)

3 小结

在本试验条件下，采用MTT法观察结果显示，浓度在480 mg·L-1～960 mg·L-1范围内，裂蹄针层孔菌发酵菌丝体可抑制肝癌HepG-2细胞生长的增殖，且这种抑制作用呈现剂量效应关系，高剂量（960 mg·L-1）能显著抑制肿瘤细胞的增殖，最佳抑制时间为24 h；通过建立荷瘤HepG-2裸鼠模型，不同剂量裂蹄针层孔菌发酵菌丝体对肿瘤的抑制作用试验结果表明，其高剂量（1 000 mg·kg-1）、中剂量（500 mg·kg-1） 对荷瘤HepG-2裸鼠有显著的抑瘤作用，抑瘤率分别为40．42%、35．06%。体外及体内实验均显示，裂蹄针层孔菌发酵菌丝体对人肝癌HepG-2细胞有较好的抗肿瘤作用。

[1]张小青，戴玉成．中国真菌志[M]．北京：科学出版社，2005：117-191．

[2]卯晓岚．中国大型真菌[M]．郑州：河南科技出版社，2000：465-468．

[3]Zhu T,Guo J,Collins L,et al．Phellinus linteus activates different pathways to induce apoptosis in prostate cancer cells[J]．British Journal of Cancer．,2007,96(4):583-590．

[4]刘云，胡珊珊，朱欣婷，等．裂蹄木层孔菌醋酸乙酯萃取物抗肿瘤活性初探[J]．时珍国医国药，2012，23（9）：2234-2236．

[5]郑立军，王清，季俊虬，等．药用真菌——桑黄的研究进展[J]．现代中药研究与实践，2005，19（3）：61-64．

[6]梁大勇，黄芳，赵晨，等．桑黄粗多糖除蛋白及抗肿瘤活性[J]．生物加工过程，2012，10（3）：56-60．

[7]杨艳果，徐少勇，杜勇，等．酒石酸锑钾对人结肠癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用[J]．武汉大学学报：医学版，2006，27（5）：633-635．

Inhibition Effect on the Liver Cancer Cell(HepG-2)of Fermentation Mycelium of Phellinus linteus

ZHANG Wen-jun1,WU Ya-zhao1,LEI Ping1,XIE Yan-hua2,DU Fang1
(1．Shaanxi Microbioogy Research Institute,Xi’an 710043,China;2．The Fourth Medical University,Xi’an 710032,China)

The inhibition effect on HepG-2 of Phellinus linteus mycelium was studied．The survival rates of cancer cell by different concentration mycelium using MTT method were determined,and through establish tumor bearing HepG-2 mice model, the inhibition effect of different dose mycelium on tumor was studied．The results demonstrated that mycelium could inhibit HepG-2 cell proliferation in a dose-dependently,high dose of 960 mg·L-1could significantly suppress cancer cell proliferation with the optimum time of 24 hours．The mycelium also have outstanding tumor suppression on tumor bearing HepG-2 mice,with inhibitory rates of 40．42%and 35．06%at the respective doses of 500 mg/kg·d and 1000 mg/kg·d．The fermentation mycelium of P.linteus had stronger inhibition effect on HepG-2．

Phellinus linteus;fermentation mycelium;HepG-2;anti-tumor effect

S646.9

A

1003-8310（2015）06-0060-03

10．13629/j．cnki．53-1054．2015．06．015

陕西省科技厅自然科学基础研究计划项目（2013JM3021）；陕西省科学院应用基础与产业化项目（2012K-17、2014K-14）；西安市科技局技术转移促进工程（CXY1348（4））。

张文隽（1977-），女，硕士，助理研究员，主要从事食（药）用真菌方面的研究。E-mail:zhwj2002199@sina．com

**通信作者：雷萍（1966-），女，副研究员，主要从事食（药）用菌菌种选育、人工栽培及深加工产品的研究与开发。E-mail:wuleiping2529@126．com

2015-09-20