自动化工作站批量提取烤后烟叶DNA方法的建立与应用

余 婧，赵杰宏，邹 颉，付 强，张孝廉

（1．贵州省烟草科学研究院，烟草行业烟草分子遗传重点实验室，贵州 贵阳550081；

2．贵州烟叶复烤有限责任公司铜仁复烤厂，贵州 铜仁554300）

烟草及烟草制品的出口创汇是国际贸易的重要壁垒，因此，建立高效、快速、准确的烤后烟叶转基因成分检测技术至关重要，而基于DNA 检测的PCR技术中，获取高质量的DNA 模板是转基因检测的前提［1］。在GB／T 24310－2009《烟草及烟草制品转基因检测方法》中［2］，烤后烟叶DNA 的提取方法为CTAB法，操作人员需要接触氯仿等有毒试剂，且该方法为手工提取，耗时较长。目前，自动化DNA 提取技术在医学中得到广泛应用，已有关于人的骨骼、血液、毛发等特殊样本的DNA 自动化提取方法［3－7］，但该技术应用于植物DNA 的提取鲜见报道。磁珠法DNA 提取方法是利用细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的DNA 分子被吸附到磁性颗粒表面，蛋白质等分子不被吸附而留在溶液中，在磁场作用下，磁性颗粒与液体分开，回收颗粒，再用纯水或TE 洗脱吸附的DNA［8］。该方法无需使用氯仿、异戊醇等有机溶剂，可整合自动化工作站批量提取生物DNA。因此，笔者采用BioMek NXP自动化工作站（96通道）与国产磁珠法植物DNA 提取试剂盒相结合，建立了自动化批量提取烤后烟叶DNA（作为PCR 模板）的方法，以获取高质量的烤后烟叶DNA 满足PCR 检测的需求。

1 材料与方法

1．1 烟叶、试剂与仪器

烟叶：取烤后烟叶300g左右（混合样），报纸包好置于烘箱50℃过夜烘干，用粉碎机研磨成细粉后直接用于DNA 提取。

试剂：磁珠法植物DNA 提取试剂盒（长春市志昂生物科技有限公司产品），内含磁珠原液、裂解液、提取液、洗涤液，洗涤液按说明书要求加入异丙醇，80% 乙 醇 及 无 水 乙 醇 自 备；rTaq 酶（货 号DR100A）、DNA Marker、6×Loading buffer均为大连宝生物公司产品。

仪器：BioMek NXP自动化工作站（美国BECKMAN 公司），含96 通道机械臂、磁力架、振荡加热模块，机械臂可实现样品及枪头盒在各工作模块的转移、加样、洗脱等操作；NanoDrop2000 超微量分光光度计（美国Thermo公司）；C1000Touch PCR仪（美国BIO－RAD公司）；ChemiDocXRS 凝胶成像系统（美国BIO－RAD 公司）；Centrifuge 5471R 离心机（德国eppendorf公司）；国产恒温水浴锅。

1．2 BioMek NXP耗材配置及程序

参照磁珠法植物DNA 提取试剂盒操作流程略作修改，在BioMek NXP自动化工作站上进行耗材的配置及软件程序的编写。

1．3 材料预处理

取70～100mg烟叶粉末，加入450μL裂解液，65℃水浴10min或30min，加入150μL提取液，室温放置5min，12 000r／min离心10min，取80μL上清液至96孔深孔板。磁珠原液在使用前按1∶10（V／V）加入无水乙醇制成磁珠混合液，洗涤液在使用前按3∶2（V／V）比例加入异丙醇。

1．4 DNA 提取

将96孔深孔板置于工作站模块台面上，点击操作软件，按以下程序运行：加入100μL磁珠混合液；27℃振荡60s，静置3min，27℃再次振荡60s，静置1min；吸磁2 min，弃废液；加入150μL 洗涤液，27℃振荡90s；吸磁60s，弃废液；加入80%乙醇380μL，27℃振荡90s，吸磁60s，弃废液，该步骤重复2～4次；56℃干燥15min；加入60μL 灭菌双蒸水，65℃振荡20s，室温放置5min，吸磁2 min；吸出50μL DNA溶液至96孔PCR 板中备用。

1．5 DNA 质量评价

1．5．1 紫外吸收法 取1μL 烤后烟叶DNA 溶液，用NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA纯度及浓度。根据国家标准GB／T 24310－2009《烟草及烟草制品 转基因检测方法》规定，DNA 提取物浓度≥100ng／μL，DNA 提取物纯度在1．7≤OD260／OD280≤1．9，计算DNA 提取合格率。

1．5．2 琼脂糖凝胶电泳检测 取DNA 合格率最高的处理，且在OD260nm 处有明显吸收峰的烟叶DNA 溶液5μL，1%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为恒压100V、缓冲液为1×TAE，通过凝胶成像系统对基因组DNA 质量进行观察拍照。

1．6 定性PCR 扩增的适应性检测

为验证上述方法提取的DNA 是否适用于普通PCR 扩增，取DNA 溶液稀释至100ng／μL为模板，对烟草内源硝酸还原酶基因（NR）进行定性PCR 扩增。根据国家标准GB／T 24310－2009《烟草及烟草制品 转基因检测方法》中NR 引物检索基因原序列，设计并合成NR 基因特异性引物（5’－CCGGAGGCGGTGGTTCAAAGTA－3’，5’－AAGTTCAGCATCAACATGGGGAGG－3’；扩增片段266bp）。PCR反应体系20μL：10×PCR Buffer 2μL，dNTP 1μL，rTaq 0．2μL（5 U／μL），DNA 1μL（100ng／μL），引物各1μL（10μmol／L）。PCR 反应条件：95℃预变性5min；94℃30s，65℃45s，72℃45s，35个循环；72℃延伸5 min。反应结束后加入6×Loading buffer 5μL，混匀后取8μL 于凝胶成像系统中检测。

2 结果与分析

2．1 烟叶DNA 溶液的浓度及纯度

从表可知，处理1 收集到的DNA 溶液纯度差且呈淡黄色浑浊状，可能是由于样本量较大，裂解不充分，且水浴时间过长，烟叶中的酚类物质容易氧化而发生褐化，在后期2次80%乙醇洗涤中不能完全洗去杂质。处理4 提取的DNA 浓度较为理想，平均值为153．3ng／μL，且纯度在OD260／OD280的平均值为1．81，标准偏差（SD）为0．06，样本总合格率达95．8%，且最后收集到的DNA 溶液基本无色素污染。表明，处理4 提取的DNA 效果较其他3 种处理好。

表 不同处理自动化提取烟叶DNA的浓度及纯度Table Comparison of the concentration and purity of automatic extracted DNA by different treat

图1 处理4自动化提取烤后烟叶的DNA波长扫描Fig．1 Wavelength of the flue－cured tobacco DNA extracted by automation workstation

对处理4提取的DNA 进行检测，在260nm 处有明显的吸收峰（图1），说明提取的DNA 杂质（多糖及其他代谢产物）含量少，纯度较高。

2．2 提取烟叶DNA溶液质量

从图2看出，DNA 条带呈弥散、拖尾状，这是由于烟叶在调制过程中经过高温（68℃左右）处理后基因 组DNA 降 解 严 重［9－10］导 致。但DNA 主 带 清 晰，且DNA 纯度稳定性较好，符合PCR 检测需要。

图2 处理4提取烤后烟叶DNA凝胶电泳图谱Fig．2 Gel electrophoresis of the flue－cured tobacco DNAextracted by automation workstation

图3 自动化提取烤后烟叶DNA NR 基因PCR 扩增图谱Fig．3 PCR amplification result of NR－gene

2．3 定性PCR 的适应性检测

从图3 看出，提取烟叶DNA 模板均能扩增出266bp左右的特异性条带，表明，DNA 溶液中无酚类、多糖等次生物质抑制Taq酶活性，且在自动化提取过程中，样品经80%乙醇洗涤后在加热振荡器上56℃干燥15 min能有效去除残留乙醇。表明，处理4提取的DNA 符合PCR 定性扩增检测要求。

3 结论与讨论

通过磁珠法结合自动化工作站提取烤后烟叶DNA，处理4 提取的纯度及浓度的总合格率为95．8%，且样品中无酚类、多糖、乙醇等影响Taq酶活性的残留物质，DNA 可直用于PCR 反应。自动化工作站硬件及软件程序适配后，操作人员只需负责预处理、加样及上机，系统即可根据软件设计程序，自动化提取DNA。其中，样本初始量及80%乙醇洗涤次数是DNA 提取的关键，样本量过大则裂解不充分且离心不完全，所取上清液中仍有浑浊的粉末残留，80%乙醇多次洗涤也很难获得高质量的DNA，而在控制好初始样本量的情况下（一般为70mg），80%乙醇4次洗涤能进一步纯化DNA，不会对DNA 浓度造成损失。

烤后烟叶DNA 提取的经典方法，即CTAB 法在提取过程中为人工提取，当样本量较多时需耗费较大的人力，且样品交叉污染可能性增大。本研究建立的自动化提取方法，相对于人工提取而言，样本量越大提取优势越明显，以96份样品的提取工作为例，样本经裂解、水浴、离心后取上清液至96孔深孔板，上样后系统运行约110min便可完成96份样的提取工作；而CTAB法提取烤后烟叶DNA，每个操作人员工作8h最多只能提取48份样品。

目前，基于DNA 提取的PCR 检测技术已在分子标记辅助育种、亲缘关系分析、基因定位及种子纯度鉴定等基础研究及应用领域得到广泛应用，而大规模的PCR 检测中，DNA 模板的制备是进行大批量分子检测的基础［11］。本研究所建立的提取方法同样适于玉米、水稻等其他作物的高通量DNA 提取工作，但根据植物材料DNA 提取特性的不同，需对前处理进行优化及自动化工作站软硬件的适配，以提取到适于PCR 检测的DNA 模板。

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