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日本仙菜来源内生真菌Aspergillus versicolor EN-298化学成分研究

2015-04-11王佳宁李晓明徐刚明王斌贵

海洋科学 2015年6期
关键词:指示菌柱层析波谱

王佳宁 , 李晓明 张 鹏 , 徐刚明 王斌贵

(1.中国科学院 海洋研究所 实验海洋生物学重点实验室, 山东 青岛 266071; 2.中国科学院大学, 北京 100049)

海洋天然产物是海洋动物、植物以及微生物体内的组成成分或其代谢产物, 是许多新药制剂或药物先导化合物的重要来源。近几年的研究发现, 许多分离自海藻、海绵、珊瑚等海洋动、植物中的天然产物很有可能是由其共生或附生的海洋微生物协同作用产生的[1]。目前已发现的微生物约 150多万种,其中72 000种存在于陆地, 而海洋微生物仅1 500种,因此仍有大量的海洋微生物资源有待深入研究[2]。随着对海洋资源的开发日益深入, 海洋微生物次生代谢产物的研究受到越来越多的关注。

本文报道了从烟台养马岛采集的日本仙菜(Ceramium japonicum)中分离得到的一株海洋内生真菌Aspergillus versicolorEN-298, 并从其发酵粗提物中分离得到10个单体化合物。通过一维、二维核磁共振技术(1D、2D NMR)、质谱技术(MS)鉴定了所有单体化合物的结构。分别是: 5-O-methylsulochine acid(1), isosulochrin (2),ω-hydroxyemodin (citreorosein) (3),emodin-6.8- dimethyl ether (4), 4, 4'-dihydroxy- 5, 5', 7,7'- tetramethoxy- 2, 2'-dimethyl-9, 9'-bianthracene- 10, 10'(9H, 9'H)-dione (5), 4, 4'-dihydroxy-5, 5', 7, 7'-tetramethoxy-2, 2'-dimethyl-9, 9'-bianthracene-10, 10'(9H, 9'H)-dione(6), wentilactone A (7), wentilactone B(8), wentilactone C (9)及 berkedrimane B (10)。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Bruker Avance 500 MHz核磁共振仪, TMS内标;薄层色谱硅胶 GF254和柱色谱硅胶(100~200目;200~300目)为青岛海洋化工厂分厂产品; Lobar LiChroprep RP-18 硅胶 (40~63 μm, Merck); 显色剂为茴香醛硫酸溶液和碘; 所用有机溶剂为重蒸的工业级溶剂。

1.2 菌株发酵

(1) 菌株: 菌株A.versicolorEN-298分离自2013年 6月采自烟台养马岛的日本仙菜(Ceramium japonicum)。通过形态学观察与ITS序列系统发育分析,将该菌株鉴定为杂色曲霉(Aspergillus versicolor)。

(2) 菌株发酵: 菌种于 4℃以琼脂–麦芽膏培养基保存。发酵采用改良 PDB培养基, 组成为: 蔗糖6.0 g, 甘露醇6.0 g, 蛋白胨1.5 g, 酵母浸粉0.9 g,含20%土豆汁的纯海水300 mL。

采用1 L三角烧瓶发酵培养, 每瓶装液体培养基300 mL, 116 ℃灭菌30 min后接种。共接种液体培养基 18 L, 于 28 ℃恒温, 自然光条件下培养 30 d,分别收集菌丝体和发酵液。

1.3 提取分离

收集发酵液约18 L, 用乙酸乙酯萃取。菌丝体晾干、粉碎后用丙酮: 水(4:1)浸泡。将丙酮蒸出, 水相用乙酸乙酯萃取, 萃取物经薄层层析检测发现与发酵液萃取物一致, 合并得粗提物20.5 g。

图1 化合物1–10的结构Fig.1 Structures of compounds 1–10

将上述粗提物进行硅胶VLC柱层析, 以石油醚-乙酸乙酯、氯仿-甲醇体系梯度洗脱, 经TLC检测合并为9个组分(Fr.1-9)。其中组分Fr.4经反相硅胶柱层析, Sephadex LH-20(甲醇)凝胶柱层析与反相硅胶柱层析分离得到化合物1(13.0 mg), 2(40.0 mg), 3(5.0 mg),4(5.5 mg), 5(8.0 mg), 6(6.5 mg); 组分Fr.5经反相硅胶柱层析, 制备薄层层析(pTLC)分离得到化合物7(8.0 mg), 8(5.8 mg); 组分Fr.6经反相硅胶柱层析,正相硅胶柱层析和制备高效液相(pHPLC)得到化合物 9(8.0 mg), 10(25.0 mg)。

1.4 抑菌活性MIC测试

(1) 病原指示菌: 溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda), 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus), 哈氏弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。

(2) 指示菌菌悬液制备: 指示菌接种于LB培养基表面, 于37 ℃培养24 h后, 吸取2 mL无菌0.85 %NaCl溶液洗涤培养物, 并用玻璃刮刀将菌刮下。用移液枪吸取适量菌悬液于无菌试管中, 然后用0.85 % NaCl溶液将菌悬液调至0.5麦氏浊度(相当于1.5×108CFU/mL)

(3) 抑菌活性 MIC测试: 采用微量肉汤稀释法[3],测定化合物的抗菌活性。以氯霉素为阳性对照, 采用无菌操作, 将倍比稀释后不同浓度的样品溶液分别加到无菌的96孔聚苯乙烯板中, 每孔5 μL。然后取95 μL麦氏浊度为0.5的指示菌悬液, 依次加入到96孔板中。轻轻震荡后, 将 96孔板置于 37 ℃培养箱中, 培养24 h, 在600 nm波长下使用酶标仪测定每孔的吸光值, 以完全抑制指示菌生长的最低样品浓度为该化合物的MIC值。

2 化合物结构鉴定与抗菌活性

化合物 1: 黄色固体, UV (MeOH)λmax(logε)202 (4.50), 282 (4.09) nm;1H-NMR (500 MHz,acetone-d6)δH: 6.68 (1H, d,J= 2.7 Hz, H-4); 7.11 (1H,d,J= 2.7 Hz, H-6); 3.73 (3H, s, H-9); 3.87 (3H, s,H-10); 3.73 (3H, s, H-11); 6.21 (2H, br s, H-3'/5'); 2.23(3H, s, H-7');13C-NMR(100 MHz, acetone-d6)δC:129.5 (C-1, C); 125.2 (C-2, C); 158.2 (C-3, C); 103.5(C-4, CH); 161.2 (C-5, C); 106.1 (C-6, CH); 198.6(C-7, C); 166.6 (C-8, C); 52.3 (C-9, CH3); 56.0 (C-10,CH3); 56.6 (C-11, CH3); 110.4 (C-1′, C); 161.8 (C-2′/6′,C); 108.7 (C-3′/5′, CH); 147.4 (C-4′, C); 21.9 (C-7′,CH3)。其波谱数据和文献报道值一致[3,7], 因此将该化合物鉴定为5-O-methyl sulochine。

化合物2: 橙黄色固体, UV (MeOH)λmax(logε)201 (4.30), 281 (3.92) nm;1H-NMR (500 MHz, acetone-d6)δH: 6.67 (1H, d,J= 2.7 Hz, H-4); 6.99 (1H, d,J= 2.7 Hz, H-6); 3.66 (3H, s, H-9); 3.82 (3H, s, H-10);6.19 (2H, s, H-3'/5'); 2.20 (3H, s, H-7');13C-NMR (100 MHz, acetone-d6)δC: 131.3 (C-1, C); 127.8 (C-2, C);156.5 (C-3, C); 107.1 (C-4, CH); 161.7 (C-5, C); 107.2(C-6, CH); 201.3 (C-7, C); 167.5 (C-8, C); 52.8 (C-9,CH3); 56.5 (C-10, CH3); 111.3 (C-1', C); 163.5 (C-2'/6',C); 109.4 (C-3'/5', CH); 148.8 (C-4', C); 22.5 (C-7',CH3)。其波谱数据文献报道值一致[4], 因此将该化合物鉴定为isosulochrin。

化合物 3: 黄色粉末, UV (MeOH)λmax(logε)201 (3.90), 221 (3.96) nm, 251 (3.74);1H-NMR (500 MHz, acetone-d6)δH: 12.14 (1H, s, 1-OH); 7.32 (1H, s,H-2); 4.77 (2H, s, 3-CH2OH); 7.72 (1H, s, H-4); 7.28(1H, d,J= 2.4 Hz, H-5); 6.56 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-7);12.2 (1H, 8-OH);13C-NMR (100 MHz, acetone-d6)δC:162.1 (C-1, C); 120.5 (C-2, CH); 152.2 (C-3, C); 117.3(C-4, CH); 131.2 (C-4a, C); 110.8 (C-5, CH); 165.6(C-6, C); 107.9 (C-7, CH); 165.6 (C-8, C); 109.7 (C-8a,C); 190.0 (C-9, C); 114.7 (C-9a, C); 181.8 (C-10, C);133.6 (C-10a, C); 62.9 (3-CH2OH)。其波谱数据和文献 报 道 值[5]一 致, 鉴 定 为 ω-hydroxyemodin(citreorosein)。

化合物4: 淡黄色粉末, UV (MeOH)λmax(logε)201 (3.27), 224 (3.35) nm, 275 (3.10);1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δH: 7.06 (1H, s, H-2); 7.55 (1H, s, H-4);7.44 (1H, d,J= 2.5 Hz, H-5); 6.76 (1H, d,J= 2.5 Hz,H-7); 2.42 (3H, s, 3-Me); 3.98 (3H, s, 6-OMe); 4.01(3H, s, 8-OMe); 13.07 (1H, s, 1-OH);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δC: 162.7 (C-1, C); 124.8 (C-2, CH);146.9 (C-3, C); 119.9 (C-4, CH); 104.0 (C-5, CH);165.3 (C-6, C); 104.8 (C-7, CH); 163.0 (C-8, C); 184.7(C-9, C); 182.9 (C-10, C); 132.4 (C-4a, C); 115.3 (C-8a,C); 114.8 (C-9a, C); 132.4 (C-10a, C); 21.9 (3-Me);56.0 (6-OMe); 56.6 (8-Me)。其波谱数据文献报道值[6]一致, 因此将该化合物鉴定为 emodin-6.8-dimethyl ether。

化合物 5: 黄色粉末, UV (MeOH)λmax(logε)257 (4.28), 270 (4.36) nm, 363 (4.35);1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δH: 6.36 (1H, br s, H-2); 6.71 (1H, br s,H-4); 5.38 (1H, d,J= 2.3 Hz, H-5); 6.73 (1H, d,J=2.3 Hz, H-7); 4.37 (1H, s, H-9); 3.62 (3H, s,1-OMe);3.77 (3H, s, 3-OMe); 2.42 (3H, s, 6-Me);12.78 (1H, s, 8-OH);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δC:163.7 (C-1, C);99.2 (C-2, CH); 162.9 (C-3, C); 106.4(C-4, CH); 119.7 (C-5, CH); 146.1 (C-6, C); 116.2(C-7,CH); 162.0 (C-8, C); 56.7 (C-9, C); 187.5 (C-10, CH);141.6 (C-4a, C); 117.1 (C-8a, C); 143.6 (C-9a, C);114.8 (C-10a, C); 55.6 (1-OMe); 57.6 (3-OMe); 22.4(6-Me);。其波谱数据与文献报道值[7]一致, 因此将该化合物鉴定为8, 8'-dihydroxy-1, 1',.3, 3'-tetramethoxy-6, 6'-dimethyl-10, 10'-bianthrone。

化合物6: 淡黄色粉末, UV (MeOH)λmax(logε)258 (4.30), 274 (4.34) nm, 362 (4.27);1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δH: 6.44 (1H, br s, H-2); 5.95 (1H, br s,H-4); 6.00 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-5 ); 6.67 (1H, d,J=2.2 Hz, H-7); 4.26 (1H, s, H-9); 3.90 (3H, s, 1-OMe);3.77 (3H, s, 3-OMe); 2.26 (3H, s, 6-Me); 12.65 (1H, s,8-OH);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δC: 163.0 (C-1,C); 99.7 (C-2, CH); 164.0 (C-3, C); 106.3 (C-4, CH);120.4 (C-5, CH); 145.8 (C-6, C); 116.6 (C-7, CH);162.3 (C-8, C); 57.9 (C-9, C); 187.2 (C-10, CH); 146.1(C-4a, C); 116.3 (C-8a, C); 115.7 (C-9a, C); 139.9(C-10a, C); 56.4 (1-OMe); 55.6 (3-OMe); 22.3 (6-Me)。其波谱数据文献报道值[7]一致, 因此将该化合物鉴定为 8, 8'-dihydroxy-1, 1', 3, 3'-tetramethoxy-6,6'-dimethyl-10, 10'-bianthrone。

抗菌活性测定: 对分离得到的化合物进行了抗菌活性测试, 受试菌包括溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus), 迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda),副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和哈氏弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。测试结果表明化合物 10对迟缓爱德华氏菌表现出一定的抑制活性, 其 MIC值为16 μg/mL。该抑菌活性为首次报道。

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