海带粗多糖对斜带石斑鱼血清指标的影响

李文武, 殷光文, 林 希, 黄志坚, 林建斌, 江和基, 朱庆国

(1.福建农林大学 动物科学学院 福建省动物药物工程实验室, 福建 福州 350002; 2.福建省淡水水产研究所, 福建 福州 350002 )

鱼类血清指标分析能反映鱼类品种的特性及生理状态, 是研究鱼类血清非特异性免疫和血清生化特性的重要内容[1]。鱼机体出现病变时, 其血清指标会发生变化, 通过检测血清相关指标的变化, 可以对鱼的病理情况做出诊断[2]。已有研究表明, 鱼类血清指标的变化范围较大, 与品种、年龄及生长环境等因素有关[3]。

海带粗多糖是从海带中提纯的多糖成分, 包括褐藻胶、褐藻糖胶和海带淀粉[4-5], 具有广泛的生物活性。目前国内外研究已表明海带粗多糖具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗辐射、抗凝血、抗动脉粥样硬化、消炎和免疫调节等作用。近年来, 也有研究表明海带粗多糖对肥胖和糖尿病有缓解和治疗作用[6]。对于多糖对鱼类血清指标影响的研究, 国内外已有相关研究和报道[7-11], 但对斜带石斑鱼血清研究较少,仅张海发等[12]对斜带石斑鱼血清性状及生化指标的研究较为全面, 对海带粗多糖对斜带石斑鱼血清指标影响的研究也尚未见报道。本试验通过在基础鱼饲料中添加不同比例的海带粗多糖, 研究海带粗多糖对斜带石斑鱼血清生化和非特异性免疫指标的影响, 旨在摸索出海带粗多糖作为鱼饲料添加剂的最佳添加比例, 丰富藻类多糖促进水产病害绿色防治的基础研究[13]。

1 材料与方法

1.1 试验鱼饲养管理

试验鱼为福建厦门小嶝水产养殖场人工培育的斜带石斑鱼幼鱼, 平均体质量为90 g±2.6 g, 平均体长为15 cm±2.25 cm。石斑鱼鱼苗运到福建省淡水水产研究所养殖试验场地, 放入暂养水桶中驯养两周,用10 mg/L的土霉素溶液消毒, 选取体格健壮、大小规格基本一致的个体, 随机放入8个150 L的水族箱中, 每组2缸, 每缸15尾, 每缸配备一台小型循环过滤器来净化水体, 称量初始体质量后开始试验。每天8: 00~8: 30和17: 00~17: 30定时投喂, 每次达到表观饱食后停止投喂(投喂量约为体质量的 3%)。每天检测水质情况, 每天清洗循环过滤器, 每周清洗水缸,并用土霉素消毒。试验用水为一级过滤海水, 避光饲养, 用增氧机昼夜持续增氧, 每次投喂1 h后吸出粪便, 每天傍晚换水约1/3~1/2, 以保持水质清新。试验期间, 水温 24~30℃, pH 值为 8.0±0.3, 溶氧质量浓度>7.0 mg/L, 氨氮质量浓度<0.2 mg/L。试验期为48 d。

1.2 试验期日粮的配制

海带粗多糖购自爱迪森(北京)生物科技有限公司, 主要成分为褐藻胶、褐藻糖胶和海带淀粉, 总糖含量 38.9%。在粉状饲料(购自福建天马科技集团股份有限公司)中分别添加 0%、0.5%、1.0%、1.5%饲料营养成分(表1), 对应分别为对照组、0.5%组、1.0%组、1.5%组。各组饲料原料混匀后制成4 mm粒径的软颗粒料, 之后分装入自封袋, 置于 4℃冰箱冷藏备用, 软颗粒料每3 d制作1批, 弃去3 d剩下的饲料,用新料投喂。

表1 基础日粮营养成分表Tab.1 Nutrition of the basal diet

1.3 样品采集

试验结束后, 禁食 24 h, 每缸鱼整体称质量后,随机取10尾鱼, 用毛巾包裹并蒙住眼睛, 2.5 mL采血针心脏采集血清, 4℃冰箱静置过夜, 吸取上清液,–40℃保存待检。

1.4 测定指标和方法

1.4.1 血清细胞因子测定

细胞因子 IL-2、IL-6和 IFN-α的测定均采用ELISA法测定。试剂盒由南京建成生物工程研究所提供, 操作按说明书进行。

1.4.2 血清生化测定

血清生化测定采用IDEXX VetTest®兽医全自动干式生化分析仪(购自北京安普生化科技有限公司),按显示屏指示下的简单操作步骤, 自动滴注血清样品, 快速给出并打印检测报告。

1.4.3 血清免疫指标测定

SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法; C3、C4和LZM活性测定采用比浊法;AKLP活性测定采用对硝基苯磷酸盐法。所用试剂盒均购自南京建成生物技术研究所, 操作按各说明书进行。

1.4.4 统计学处理

试验数据用EXCEL和SPSS 19.0数据处理软件中方差分析(ANOVE)进行单因素数理统计, 并对均数做LSD多重比较, 结果均以平均数±标准差表示。

2 结果

2.1 海带粗多糖对斜带石斑鱼血清细胞因子水平的影响

如表2所示, 与对照组相比, 各实验组血清中IL-2、IL-6与IFN-α水平均有一定程度的提高。其中0.5%组各因子水平均极显著高于对照组(P<0.01);1.0%组 IL-2与 IL-6水平均极显著高于对照组(P<0.01), IFN-α水平显著高于对照组(P<0.05); 1.5%组IL-2、IL-6与IFN-α水平均高于对照组, 但未达到显著水平(P>0.05)。

表2 海带粗多糖对斜带石斑鱼血清中细胞因子水平的影响Tab.2 Effect of laminarin on serum cytokines in Epinephelus coioides

2.2 海带粗多糖对斜带石斑鱼血清非特异性免疫的影响

由表3可见, 与对照组相比, 各实验组 LZM、CAT、SOD的活力均有所提高, C3、C4含量均有一定程度的降低。其中, 随添加量的增加, CAT和SOD活性逐渐下降, LZM先降后升, C3、C4含量逐渐升高, 但均低于对照组; 0.5%组LZM活性显著高于对照组(P<0.05), CAT和 SOD活性极显著高于对照组(P<0.01), C3含量显著低于对照组(P<0.05), C4含量极显著低于对照组(P<0.01); 1.0%组CAT活力显著高于对照组(P<0.05), C4含量显著低于对照组(P<0.05)。

表3 海带粗多糖对斜带石斑鱼血清非特异性免疫指标的影响Tab.3 Effect of laminarin on non-specific immune response in Epinephelus coioides

2.3 海带粗多糖对斜带石斑鱼血清生化指标的影响

由表4可见, 经过48 d的喂养试验, 与对照组相比, 各试验组均能显著提高血清TP含量, 其中0.5%组和1.0%组与对照组差异极显著(P<0.01), 1.5%组与对照组差异显著(P<0.05); 降低血清中 UREA水平,0.5%组与对照组相比差异显著(P<0.05), 但 1.0%组和1.5%组差异不显著(P>0.05); 降低CREA水平, 且随添加量增加, CREA水平依次降低, 1.5%组与对照组相比差异显著(P<0.05), 0.5%组和1.0%组差异不显著(P>0.05); 虽0.5%组和1.5%组ALP值比对照组低,1.0%组比对照组高, 但差异均不显著(P>0.05); 添加量为 0.5%时能显著提高 AST酶活力(P<0.05), 添加量为1.0%与1.5%时其AST活力先降后升, 但差异均不显著(P>0.05); 对于ALT, 各试验组与对照组相比,其ALT的酶活力变化不大, 差异不显著(P>0.05)。

表4 海带粗多糖对斜带石斑鱼血清生化指标的影响Tab. 4 Effect of laminarin on plasma biochemical parameters in Epinephelus coioides

3 讨论

3.1 海带粗多糖对斜带石斑鱼血清细胞因子水平的影响

细胞因子是由活化的免疫细胞和非免疫细胞合成分泌的一类生物活性小分子多肽, 具有调节细胞生理、参与组织修复、介导炎症反应等作用。细胞因子IL-2、IL-6与IFN-α, 按来源分属淋巴因子, 即由活化的淋巴细胞产生, 是机体免疫系统中重要的信息物质。脾脏是粒细胞发生的初始场所, Ryu等[14]研究发现海带粗多糖能诱发小鼠脾细胞增生, 明显增强细胞毒性 T细胞 (CTLs)和自然杀伤细胞(LAKs)的活性, 提高IL-2的表达量。Smith等[15]发现日粮添加300 mg/L LJPS能显著提高LPS应激的断奶仔猪回肠和结肠 IL-6(P=0.0289)和 IL-8(P=0.0245)的表达量, 结果都佐证了海带粗多糖具有免疫调节活性。本试验组中, 细胞因子IL-2、IL-6与IFN-α的水平均高于对照组, 表明海带粗多糖能促进斜带石斑鱼机体对3种细胞因子的分泌, 提高机体的免疫水平。其随海带粗多糖添加量的增加各因子的分泌水平呈现负相关性, 这可能与海带粗多糖浓度有关。结果表明,海带粗多糖具有促进斜带石斑鱼血清 IL-2、IL-6与IFN-α的分泌和提高机体免疫调节能力, 对促进石斑鱼健康生长具有重要意义[16-17], 但在实际使用海带粗多糖时要控制好所添加的含量。

3.2 海带粗多糖对斜带石斑鱼血清免疫指标的影响

LZM, 又称细胞壁溶解酶, 广泛存在于动物黏液、血清等中, 能专一地溶解微生物细胞壁, 已有研究表明, 淡水鱼和海水鱼的血清都有溶菌酶的存在,是鱼体体液中重要的非特异性免疫物质。CAT又称为触酶, 是一种酶类清除剂, 以铁卟啉为辅基, 它可促使H2O2分解为分子O2和H2O, 清除体内的H2O2,从而使细胞免于遭受 H2O2的毒害, 是生物防御体系的关键酶之一。SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子, 可对抗因氧自由基对机体细胞造成的损伤, 并及时修复受损细胞, SOD的水平是机体健康与否的直观指标。Kang等[18]通过临床试验证实, 海带能提高SOD和CAT的水平。Moroney等[19]研究新鲜猪肉的保质期时也发现, 海带粗多糖能延长新鲜猪肉的保质期, 提高机体内总抗氧化水平。C3、C4是补体系统的重要组成部分, 参与机体的特异性和非特异性免疫机制, 当机体补体系统过度激活, 会导致机体抗感染能力下降, 促使机体内产生剧烈的炎症反应或造成组织损伤, 引起病理变化。

本试验结果表明, 海带粗多糖能提高斜带石斑鱼体内LZM、CAT与SOD酶活力; 降低C3、C4水平, 且随添加量增加呈现负相关性, 这可能与海带粗多糖浓度有关。结果说明, 海带粗多糖能提高石斑鱼机体的抗氧化能力和非特异性免疫, 与枸杞多糖和灵芝多糖相似, 都能提高机体的非特异性免疫[20]。刘会娟[21]的研究表明, 100 mg/kg的海带粗多糖能明显提高大骨鸡血清效价, 对免疫功能有明显的促进作用, 与本试验结果一致。董学兴等[22]的研究表明,海带对SOD、CAT无显著影响, 与本研究结果不同,这可能与鱼品种和海带粗多糖效价等因素有关; Zhu等[23]发现三七中鼠李半乳糖醛酸聚糖具有固化补体的作用, Olafsdottir等[24]从地衣中分离的β-葡聚糖也具有抗补体活性。这说明, 从天然多糖中寻找抗补体活性成分已成为可能。试验也证明海带粗多糖中具有抗补体活性成分。

3.3 海带粗多糖对斜带石斑鱼血清生化水平的影响

尿素氮和肌酐在一定程度上可反映肾小球滤过功能的损害程度。本试验饲喂不同含量的海带粗多糖后可见, 斜带石斑鱼机体内的UREA和CREA含量均有不同程度的降低, 这说明海带粗多糖不会对鱼体肾脏造成损伤, 反而会提高肾脏机能; ALT与AST主要分布在肝脏的肝细胞内。肝细胞坏死时ALT和AST就会升高。其升高的程度与肝细胞受损的程度相一致, 与 ALP一起, 都是目前最常用的肝功能指标。本研究可见, 海带粗多糖能降低 ALP活性, 对AST和ALT活性影响不大, 这说明海带粗多糖不会对肝脏造成损伤。张海发等[12]研究斜带石斑鱼血清性状及血清生化时发现, 成熟亲鱼的 ALT、AST活性都较低(4

4 结论

本试验结果表明, 海带粗多糖能提高斜带石斑鱼血清非特异性免疫能力, 提高血清总蛋白含量,降低对肾脏的损伤, 能明显提高斜带石斑鱼机体的免疫功能, 且作用与海带粗多糖浓度直接相关, 因而使用海带粗多糖时要控制好浓度, 本实验中, 以0.5%添加量时效果最佳。

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