CAG的中医证型与幽门螺旋杆菌、IL-10的相关性研究*

刘长明，冯全林，张剑治，胡漪璐，杨 悌，张 颖

(南京中医药大学昆山附属医院检验科，江苏昆山 215300)

CAG的中医证型与幽门螺旋杆菌、IL-10的相关性研究*

刘长明，冯全林，张剑治，胡漪璐，杨 悌，张 颖△

(南京中医药大学昆山附属医院检验科，江苏昆山 215300)

目的:探讨慢性萎缩性胃炎(CAG)患者的证型与幽门螺旋杆菌(Hp)感染、IL-10的基因多态性及水平的相关性。方法:招募156例CAG患者及150名无Hp感染的健康人，采用C13呼气法及金标法检测Hp、ELISA检测IL-10含量、PCR-RFLP分析IL-10多态性。结果:CAG患者证型以脾胃虚弱(35.44%)与胃阴不足(27.22%)为主。CAG患者Hp的感染率为49.37%，以脾胃湿热(69.23%)、肝胃不和(68.42%)及瘀血阻络组(57.14%)较高，与其他组比较差异有统计学意义。脾胃湿热组(55.57± 12.31pg/ml)及肝胃不和组IL-10水平(48.38±13.91pg/ml)显著高于对照组(38.21±5.35 pg/ml)。IL-10基因多态性在病例及对照组之间分布比较差异无统计学意义。结论:Hp感染与CAG患者外周血的IL-10水平相关，二者均与CAG证型相关，提示中医治疗CAG时应关注患者的Hp感染及患者的IL-10水平。

慢性萎缩性胃炎;证型;Hp感染;IL-10;基因多态性

慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis， CAG)是由多种因素导致的胃黏膜反复损伤引起的胃黏膜上皮和腺体萎缩的消化系疾病，因其多伴有肠上皮化生和不典型增生而与胃癌发生关系密切［1］。CAG的病因尚不明确，现有研究普遍认为幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染、患者的免疫反应及遗传因素是其主要致病因素。现代医学治疗CAG往往疗效欠佳，而中医对CAG进行辨证施治获得良好治疗效果。研究显示，CAG的中医证型与Hp感染相关［2-3］，然而对Hp感染后患者的免疫状态及遗传背景鲜有报道。白细胞介素10(IL-10)是重要的免疫调节细胞因子，处于机体免疫调节的中心环节。本研究拟采用分子生物学、免疫学的方法分析患者的IL-10基因多态性及Hp感染，探讨其与CAG中医证型的关系，为中医治疗CAG提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象与分组

招募来自2012年1月至2013年12月期间因胃部不适来昆山市中医医院就诊并经病理确认为CAG患者共计156例。其中男性93例，女性63例，平均年龄(51±15.23)岁。招募体检正常者150例，平均年龄(52±16.35)岁，其中年龄、性别与CAG组比较差异无统计学意义。对照组经C13呼气实验及金标法检验确认无Hp感染。所有病例经脾胃病科诊断并辨证分型(脾胃虚弱、肝胃不和、脾胃湿热、胃阴不足、瘀血阻络［3-4］)。

1.2 试剂

C13呼气实验试剂盒为Isodiagnostika公司产品;金标法检测血清Hp抗体试剂盒为北京康美天鸿生物科技有限公司产品;IL-10 ELISA检测试剂盒为上海森雄科技实业有限公司产品。DNA提取试剂盒为美国Omega公司产品;RNA酶及蛋白酶K购自生工生物工程(上海)股份有限公司;DNA聚合酶由大连Takara公司提供;限制性内切酶RsaⅠ及SspⅠ均为Fermentas Life Sciences公司产品;BslⅠ为NEB公司产品;PCR扩增所用引物由上海Invitrogen有限公司合成。

1.3 Hp感染检测

患者及正常对照组经C13呼气实验及金标法检测Hp感染，二者同时确认为Hp感染阳性。正常对照组经C13呼气实验及金标法检测，同时为阴性者纳入本研究。试验步骤均依说明书按步骤完成。

1.4 IL-10血浆含量检测

采集患者及健康受试者全血分离血浆。采用ELISA法对患者及健康受试者血浆中的IL-10含量进行检测，实验操作步骤依据产品说明书进行。

1.5 CAG诊断及中医辨证分型

临床患者行胃镜活检，经病理诊断为CAG的患者接受中医治疗，由脾胃病科中医医师依临床诊断进行中医辨证分型。

1.6 基因组DNA提取及IL-10基因分型

1.6.1 DNA提取 取EDTA-K2抗凝全血，分离血浆后加入3 ml红细胞裂解液，混匀震荡5 min，800 g离心5 min沉淀白细胞;然后进行白细胞基因组DNA提取，实验步骤依照试剂盒说明书进行。

1.6.2 IL-10基因分型 采用聚合酶链反应(PCR)及限制性片段长度多态性(RFLP)技术分析IL-10(IL-10-1082、-819及-592位点)的基因多态性。经PCR扩增后产物分别用BslⅠ(IL-10-1082)、SspⅠ(IL-10-819)及RsaⅠ(IL-10-592)限制性内切酶进行酶切，酶切的方法同先前发表的论文［5］，然后进行琼脂糖凝胶电泳分型。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，计数资料用χ2检验，并通过比数比(OR)进行相关性分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用t检验统计差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CAG患者的中医证候分型

表2显示，患者以脾胃虚弱(56例，35.44%)与胃阴不足(43例，27.22%)较多，其他证型的例数排序分别为脾胃湿热、肝胃不和、瘀血阻络。

表1 PCR-RFLP法分析IL-10启动子区基因多态性

2.2 CAG患者Hp感染情况

CAG患者中有76例(49.37%)检出Hp感染，以脾胃湿热组(69.23%)、肝胃不和组(68.42%)及瘀血阻络组(57.14%)感染率较高。脾胃湿热组Hp感染率最高，与脾胃虚弱组(χ2=7.17，P= 0.007)及胃阴不足组(χ2=4.86，P=0.027)比较差异有统计学意义;肝胃不和组的Hp感染率其次，显著高于脾胃虚弱组(χ2=5.47，P=0.019)，其余各组间比较差异无统计学意义。

2.3 正常对照组及CAG患者组血清IL-10含量

表3显示，正常对照组外周血中IL-10浓度显著低于脾胃湿热组及肝胃不和组(P＜0.05)，其余各组亦均比正常对照组高，但差异无统计学意义。

2.4 CAG患者及正常对照组IL-10基因多态性分析

表4显示，正常对照组3个位点的基因型分布频率符合哈温-伯格平衡，具有群体代表性。3个基因多态性位点的基因型分布频率在2组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，与野生基因型比较差异无统计学意义。

表2 CAG患者中医辨证分型及Hp感染情况［例(%)］

表3 正常对照组及CAG患者组血清IL-10含量比较(±s)

表3 正常对照组及CAG患者组血清IL-10含量比较(±s)

注:与正常对照组比较:*P＜0.05;与CAG Hp未感染组比较:#P＜0.05

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表4 IL-10各基因型分布与CAG相对风险分析［例(%)］

3 讨论

CAG被普遍认为是胃癌的癌前病变，周阿高等［6］对近10年来文献总结显示，中医治疗CAG疗效较好。本研究结果显示，CAG证型以脾胃虚弱与胃阴不足为主，其中脾胃湿热、肝胃不和证型患者中的Hp感染率相对较高，且IL-10呈现较高水平。然而IL-10启动子区基因多态性在对照组及CAG组分布比较差异无统计学意义。

本研究观测到CAG以脾胃虚弱证型为多，与丁成华等报道一致［4］。本研究各证型的排序与魏玉霞的分析结果相一致［7］。该研究显示，证型占比顺序依次为脾胃气虚、胃阴亏虚、脾胃湿热、肝胃不和、脾胃虚寒、肝郁脾虚、瘀阻胃络、气阴两虚。Hp菌体表面的脂多糖、脲素酶及细胞毒素是引起患者免疫反应的主要因素，Hp感染引起的患者免疫反应与胃部疾病的进展相关［8］。中医治疗CAG以辨证论治为主，但仍然强调“审症求因”。一般说来，Hp属于中医学“邪气”、“热毒”范畴。外感邪气经口侵入体内，犯于脾胃，脾胃功能失常，引起胃脘部胀闷、疼痛、纳差等。外邪侵入机体后易于化热，因此本病患者多有胃热表现。另一方面，“正气存内，邪不可干”、“邪之所凑，其气必虚”。脾胃亏虚是Hp能侵入体内引起疾病的前提之一，且CAG病程一般较长，日久则正气渐虚而致脾胃虚弱。Hp感染与CAG患者证型的因果关系较为复杂。本研究对156例患者观察显示，Hp感染率为49.37%，在各证型中分布依次为脾胃湿热、肝胃不和、瘀血阻络、胃阴不足、脾胃虚弱。此与刘兴山等［9］对287例CAG患者研究发现，Hp感染与CAG证型分布(胃络瘀血＞脾胃湿热＞肝胃不和＞脾胃虚弱＞胃阴不足)结果相近。但该研究报道，Hp的总体感染率为69.34%，可能因Hp感染率地区差异所致。此外，王立等［10］对1366例Hp感染胃部疾病患者中证型依次为脾胃湿热型＞胃络瘀血型＞肝胃不和型＞脾胃虚弱型;陈飞松等［11］报道，Hp感染患者证型依次为脾胃湿热＞肝胃不和＞脾胃虚弱＞胃阴不足。虽上述研究并非针对CAG患者，但与本研究的结果相近。上述研究的证型分布除地区间Hp感染率差异外，近年来因经济条件改善、患者积极治疗亦是重要原因。

IL-10是由辅助性T细胞亚群Th2细胞分泌的一种抑制Th1细胞功能、抑制炎症的细胞因子，其处于免疫调节的中心环节，具有免疫抑制和免疫刺激的双向作用［12］。本研究显示，在CAG患者中IL-10呈现升高的趋势，以脾胃湿热组及肝胃不和组为主。此外本研究还显示，CAG患者并发Hp感染较未感染患者的IL-10更高，与张洪芳等的报道相一致［13］。但IL-10的表达与中医CAG证型的相关性迄今未见报道，本研究的结果提示IL-10与Hp感染及患者的证型相关。

近年来研究显示，IL-10基因启动子的基因多态性与IL-10的表达相关，且与胃部疾病的发生相关。课题组前期研究显示，IL-10启动子区IL-10-1082位点的GA基因型与胃癌的发生相关［5］。但本研究结果显示，IL-10基因启动子区多态性与CAG无相关性，此结果国外的研究中亦有报道［14-15］。但由于本研究所纳入的研究样本数量还相对较少，此结论有待于在中国人群中进行大样本的研究来证实。

综上所述，本研究结果提示Hp的感染与患者外周血的IL-10水平相关，且二者均与中医CAG的证型相关，提示中医治疗CAG时应关注患者的Hp感染及患者的IL-10水平。

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Study on the Association between the Distribution of Syndrome Type of Patients with Chronic Atrophic Gastritis(CAG)and Helicobacter pylori and IL-10

LIU Chang-ming，FENG Quan-lin，ZHANG Jian-zhi，HU Yi-lu，YANG Di，ZHANG Ying△
(Department of Laboratory Medicine，Kunshan Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine，Kunshan，Jiangsu 215300，China)

Objective:To explore the association between the distribution of syndrome type of patients with chronic atrophic gastritis(CAG)and Helicobacter pylori(Hp)infection and the level and polymorphisms of IL-10．Methods:156 CAG patients and 150 health people without Hp infection were enrolled;The Hp infection was tested by13C-Urea Breath Test and colloidal gold-labeled assay(GICA);The level of IL-10 was measured by Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA);Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism(PCR-RFLP)was applied to genotype the polymorphisms of IL-10．Results:In the CAG patient，the number of the syndrome type of weakness of spleen and stomach，deficiency of stomach-yin were majority．The Hp infection ratio of CAG was 49.37%，and it was higher in the patients with syndrome type of damp-heat in spleen and stomach(69.23%)，disharmony between liver and stomach (68.42%)and blood stasis of the collaterals(57.14%)，and there was significant difference between them．The IL-10 level in the patients with type of syndrome of damp-heat in spleen and stomach(55.57±12.31pg/ml)and disharmony between liver and stomach(48.38±13.91pg/ml)was significant higher than that in health controls(38.21±5.35pg/ ml)．There was no difference of the distribution of IL-10 genotypes between patients and health controls．Conclusion:The Hp infection was related with IL-10 level in the CAG patents．the Hp infection and IL-10 level were associated with the syndrome type of CAG patients．It is indicated that Hp infection and level IL-10 should be considered in the treatment for the CAG patients according to the syndrome type．

Chronic Atrophic Gastritis(CAG);Syndrome types;Helicobacter pylori infection;IL-10; polymorphism

R573．3+2

B

1006-3250(2015)10-1271-04

2015-02-18

江苏省中医药局科技项目(LZ13157，YB2015105);昆山市科技发展项目(ks1361，ks1259)，(LZ13157，ks1361):胃炎I号方辨证治疗CAG的机制探讨与疗效观察(ks1259):幽门螺旋杆菌致病岛的基因变异与Th1型细胞因子的遗传多样性的交互作用致胃癌发生风险研究;幽门螺旋杆菌基因分型与胃部疾病证型及药物敏感性的相关性研究(YB2015105)

刘长明，男，江苏金湖人，副主任技师，医学学士，从事医学检验的临床与研究。

张 颖，女，主任技师，硕士研究生导师，E-mail:kszyy_zy@126．com。