动物细胞无血清培养基的发展和应用

商 瑜，张启明，李 悦，王莹冰

(北京师范大学生命科学学院，北京 100875)

动物细胞无血清培养基的发展和应用

商 瑜，张启明，李 悦，王莹冰

(北京师范大学生命科学学院，北京 100875)

随着生物医药产业和生命科学基础研究对动物细胞培养规模、效率和安全性能要求的不断扩大和提高，无血清培养基的研制和开发已经成为细胞工程领域的重要课题。无血清培养基的发展历经了无血清来源、无动物源、无蛋白和化学成分限定培养基等四个阶段，逐步使得无血清培养基的成分更为明确和简单，进一步提升了无血清培养基在细胞培养中可避免外源物污染等的优势，使其在生物制品和生命科学领域获得了广泛的应用和发展。本文主要系统总结了无血清培养基的发展历程、组分构成和优化方法，尤其对无血清培养基近年来在生物制品、干细胞培养及肿瘤研究等方面的最新开发应用进行了扼要分析述论，以期对无血清培养基在生物学前沿领域的应用和优化提供可借鉴的方向，尤其在肿瘤干细胞的方面可以进行更深入的探索。

无血清培养基；生物制品；细胞培养

动物细胞培养技术近年来发展迅速，已经成为生物工程领域中的前沿研究课题之一。其在生物制品的生产、肿瘤细胞的体外建模、病毒的分离鉴定和机体发育功能研究等方面均有重要应用。通常，为了提供细胞生长所需的激素、生长因子等物质，动物细胞是在含血清的培养基中进行培养的。但血清成分复杂且不完全明确，批次间容易产生较大差异，培养中易发生外源物污染，并且血清本身价格也比较昂贵等；这些均使得血清在生产和研究中的应用存在诸多不利。目前，已有大量实验数据证实无血清培养基不仅能避免或改善含血清培养基所带来的上述缺陷，也能获得良好的培养效果并维持原有生物学功能[1]。欧洲替代方法研究中心科学咨询委员会(The ECVAM Scientific Advisory Committee, ESAC)和欧洲体外毒理学会(European Society of Toxicology In vitro, ESTFV)等多个机构组织均发表声明，强烈建议减少细胞体外培养过程中血清等动物源性物质的添加，尽可能在现有细胞培养领域使用无血清培养基[2]。由此可见，无血清细胞培养技术的研究日益受到人们的关注，并逐渐成为当今动物细胞体外培养领域的主流与趋势。

1 无血清培养基的发展历程

无血清培养基是在合成培养基的基础上发展起来的，与传统的培养基相比，既能满足细胞在体外长时间培养的要求，又能避免动物血清所带来的不利因素。无血清培养基的发展历程一般分为无血清培养基、无动物源培养其、无蛋白培养基及化学成分限定培养基等四类[3]。

1.1 无血清培养基(Serum-Free Medium, SFM)

无血清培养基，即为不添加动物血清。但是为了满足细胞的生长，会添加替代血清功能的生物材料，如转铁蛋白、胰岛素和动植物的提取物等。这使得此类培养基中含大量动植物来源蛋白，添加物质的化学成分也不够明确[4]。因此，会对后续处理应用造成部分不利影响(如目标蛋白的分离纯化)，同时成本也较高。由于人们可以就实际需求对其进行相对简单的成分改进，使得其应用仍较为广泛。

1.2 无动物源培养基(Animal Component Free Medium, ACFM)

此类培养基采用蛋白水解物、重组蛋白或其他化学物质来取代动物源蛋白。它既可以满足细胞生长及增殖的需要，还能够降低培养基的生产成本，提高重组蛋白类药物安全性[5]。目前主要应用于生物药品的研发和生产中。

1.3 无蛋白培养基(Protein-Free Medium, PFM)

该类培养基完全不含有血清和动物来源的蛋白，但仍包含来源于植物蛋白的水解物或合成多肽片段等其他衍生物。由于所含蛋白极低，并且蛋白成分明确，有利于重组蛋白的下游生产、分离和纯化，总体成本也会大幅下降[6-7]。但其通用性较差，需要针对目标细胞株进行特异性的优化[8]。目前主要应用于生命科学研究和基因工程药物开发等领域。

1.4 化学成分限定培养基(Chemically Defined Medium, CDM)

此类培养基完全无血清、无蛋白，成分完全明确，可以保证培养基批次间的一致性。它既有利于跟踪细胞培养的代谢情况，在后续的分离纯化中也非常方便，是目前最为安全和理想的培养基。可是并非所有的细胞都能在化学限定培养基中达到较高的表达水平，需要不断改进设计方案和配方[9]。

2 无血清培养基的组分构成和 设计优化

2.1 无血清培养基的组分构成

无血清培养基一般由基础培养基和替代血清的补充因子两部分组成。基础培养基通常是按一定比例的葡萄糖、氨基酸、无机盐和维生素等组合而成的合成培养基，它是维持组织或细胞生长代谢必不可少的物质。而补充因子，替代了传统培养基中的血清，既能有效避免血清带来的诸多问题，也能满足动物细胞培养的要求。补充因子根据需求的必要性一般分为必需补充因子和特殊补充因子。必需补充因子是所有细胞株在无血清培养基中生长时都需要的，包括胰岛素和转铁蛋白等。特殊补充因子一般含有激素、生长因子微量元素、贴壁和铺展因子、维生素和酶抑制剂等。

2.2 无血清培养基的设计优化

在无血清培养基的具体应用中，可以通过选择或优化适当的基础培养基和补充因子的种类及用量，使其更符合培养要求。例如，细胞工程的常用细胞CHO往往是利用DMEM∶F12∶RPMI1640 (2∶1∶1)[10]或者EX-CELLTM302[11]作为基础培养基，而Vero的常用基础培养基则为M199、DMEM或F12等。对于补充因子，更是不断尝试优化开发新的替代品。如必需补充因子中的胰岛素，因其费用昂贵，目前有研究报道可利用金精三羧酸(Aurin Tricarboxylic Acid, ATA)作为胰岛素替代物培养CHO细胞，细胞的生长正常，并极大降低了成本[11]。转铁蛋白是细胞无血清培养最重要的补充因子之一，它的缺失会抑制细胞的生长，同时它也是一些有害微量元素的螯合剂。Rourou等在研究Vero细胞无血清培养基时认为，维生素C和柠檬酸铁混合使用可以替代转铁蛋白，这为寻求转铁蛋白替代品提供了参考[12]。

通常，为了更好地达到无血清培养基组分优化开发，研究人员可采用培养过程分析法、分子生物技术法和统计学设计法等方法进行系统分析，进而获得满足目标细胞生长要求的无血清培养基[13]。

2.2.1 培养过程分析法 培养过程分析法是以动态的细胞代谢为基础，通过对细胞培养过程中各培养基的组分进行实时监测，了解细胞的生理状态变化，根据需求调整培养基组分及补料策略的设计方法。在细胞培养过程中，各培养组分必须维持在一定水平。因此可以通过消耗组分分析法来对葡萄糖、谷氨酰胺、维生素和氨基酸等组分进行设计；也可以通过化学计量分析法，建立培养基各组分与细胞能量代谢、生物量或蛋白合成量之间的化学计量函数，从而对基础培养基、补料培养基及补料策略进行设计。

2.2.2 分子生物技术法 分子生物技术法是以基因组学和蛋白组学技术为依托的一种高通量的设计方法。研究人员可以应用基因芯片、抗体芯片和双向凝胶电泳等技术，在mRNA和蛋白水平上获得细胞培养过程中关键基因或蛋白的变化情况，用以确定培养基中调控这些基因或蛋白表达的成分的添加类型和比例，进而调控细胞的生长、分化和凋亡等生理指标[14]。

2.2.3 统计学实验设计法 统计学实验设计法是通过在培养基的设计、优化及数据结果分析中运用统计学方法，经济地获得可靠结果，并将误差降到最低的一种设计方法。由于其省时省力，具有快速获得大量参数的优势，近年来被广泛应用于细胞培养及过程优化中，并取得了卓有成效的研究成果。如2010年Jeon等人利用分式析因设计和响应面的统计学方法对人细胞毒素T淋巴细胞无血清培养基中的卵磷脂、多胺、抗氧化剂和胆固醇进行设计优化，最终获得最高活细胞密度比有血清培养基高1.5倍的无血清培养基，而且其T淋巴细胞效应功能仍然保留[15]。

3 无血清培养基的应用

3.1 生物制品和生物药物研制与生产方面的应用

目前，生产生物活性蛋白、疫苗、单克隆抗体和基因治疗药物的表达载体等生物制品时一般都采用可高密度生长的动物工程细胞。无血清培养技术的运用，给动物工程细胞提供了更优的生长条件，进而表达更多的目的产物，并有利于后续目的产物的分离和纯化，显示了其强大的优势。Kutsuzawa等在研究新的3D培养系统时发现，无血清培养基较有血清培养基可提高大约3倍的重组蛋白产量，使该系统能更好地适用于生物制药生产[16]。为避免生物制品的血清污染，Toriniwa等研究得到一种用无血清培养基生产Vero细胞源乙型脑炎疫苗的方法，而且其疫苗可通过添加稳定剂(如山梨醇或甘氨酸)，实现在室温下储存[17]。Rodrigues等利用CHO细胞生产单克隆抗体时发现，在无血清条件下培养，就无血清培养基的基础培养基适应性进行了对比评价，指出相比于DEME培养基，EX-CELL培养基更有利于单克隆抗体的生产，这为后续单抗的研发生产奠定了良好的基础[18]。Kuroda等在研发慢病毒载体生产方法时，开发了培养人胚肾HEK 293细胞的无蛋白培养基，从而获得了低成本、无批次差异且高滴度的慢病毒载体[19]。所以说，无血清培养基清晰明确的成分以及完善的质控体系，使得制备生物制品和生物药物的宿主细胞，在培养过程中更加稳定，产物表达效率更高，产品质量更加安全可靠。

3.2 干细胞培养和研究方面的应用

干细胞(Stem Cells, SC)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，因此对其培养条件的质量控制成为关键。目前，鉴于无血清培养基拥有明确成分的特性，它已被广泛应用于干细胞的体外培养和研究中。Swamynathan等通过体外实验验证MesencultTM间充质干细胞无血清培养基相较有血清培养基，完全可以为脐带来源的间充质干细胞提供体外大规模培养所需的营养条件；无血清培养基培养的干细胞保留了临床治疗所需要的干细胞特性，并且减少了因血清带来的后续治疗中的潜在危险[1]。另一方面，研究人员不断开发新型无血清培养基，以提高培养效率或者适用于不同诱导分化需求。Zhang等利用含有SCF、TPO、FGF-1、ngiopoietin-like 5和IGFBP2等五种因子的无血清培养基可以使人脐血造血干细胞(HSC)在体外生长速度提高20倍，为临床应用提供培养条件上的支持[20]。Pick等则开发了一个无血清无滋养培养系统，他们利用该系统成功从人胚胎干细胞分化获得可产生血小板样细胞的骨髓巨核细胞，这使得人类朝干细胞诱导分化获得治疗用人类血小板又迈进了一大步[21]。最近研究报道，为了应对肠道组织天然干细胞来源不足的问题，Mahmoud等开发出一种适宜肠道干细胞体外增殖的无血清培养基，他们添加了乙醇胺、转铁蛋白、抗坏血酸磷酸盐、亚硒酸钠和谷胱甘肽等五种补充因子[22]。该成果对于基础研究和临床应用均具有积极意义。

3.3 肿瘤研究方面的应用

目前恶性肿瘤已经成为人类健康的主要威胁之一，其相关研究是生命科学最广泛、最活跃的领域。细胞培养是肿瘤研究最基本的实验平台，而无血清培养基为该领域的研究提供了有效的工具，如用于研究肿瘤细胞的生长和迁移机理的研究等[23]。最新研究显示，利用无血清培养基可以从病人原位肿瘤中提取并培养肿瘤干细胞，这类细胞保留了原有肿瘤的基本特征，并能在免疫缺陷小鼠中诱发肿瘤的发生。目前，研究人员已成功获得了乳腺癌[24]、结肠癌[25]和神经母细胞瘤[26]等的肿瘤干细胞细胞系，为进一步研究肿瘤发生发展机制提供了有力的工具和模型。更为重要的是，无血清培养基去除了血清中的促分化剂，适宜肿瘤干细胞的富集和培养。Lei等的研究表明，无血清培养可以增加前列腺癌细胞系DU145中肿瘤干细胞标志物CD133和CD44阳性的细胞比例(从0.1%±0.01%上升至10.3%)，并使得原本无CD133和CD44阳性肿瘤干细胞的PC-3细胞获得了3%的肿瘤干细胞阳性比率[27]。

在肿瘤治疗方面，免疫治疗方法已经成为肿瘤治疗的前沿领域，尤其是基于树突状细胞(Dendritic Cells, DC)的肿瘤疫苗被认为是治疗恶性肿瘤的一种有效的途径。在利用DC肿瘤疫苗治疗时，所需要的树突状细胞和用于抗原致敏的肿瘤细胞，往往在胎牛血清(Fetal Calf Serum, FCS)中进行培养，这使得很难分辨哪些免疫应答是由血清引起而非真正的先天免疫系统的作用。Bouwer等研究显示，他们利用无血清培养可以彻底解决DC肿瘤疫苗治疗中血清干扰的问题，并且还保持类似血清培养状态下的生物学功能[28]。这为进一步安全地应用DC肿瘤疫苗治疗肿瘤提供了有效方法和理论依据。

4 展望

目前，无血清培养基在理论研究和实践应用方面均已取得诸多切实有效的成果，为科学研究和国民生产做出了卓有成效的贡献。但是，由于体外培养的细胞类型具有明显的多样性，而现有无血清培养基往往适用范围较为狭窄，因此亟待需要研发出普适性强的无血清培养基配方，提高培养通用性，以能同时满足不同细胞的要求。另外，虽然无血清培养基较有血清培养基节约了血清的成本，可是有些无血清培养基的补充因子的价格仍较为昂贵，应进一步研发相对廉价而有效的替代品，降低总体成本。相信随着代谢组学、基因组学和蛋白质组学技术的不断完善，资源共享的无血清培养基在线数据库的建立[29]，以及更多科学设计方法的运用，无血清培养基的开发和优化必将会得到更快的发展。特别是生产高效性、培养通用性、安全风险和降低成本等方面应成为今后无血清培养基深入改进的重点方向，从而使其能在生物医药行业和生命科学基础研究等领域得到更为广泛而安全的应用。

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〔责任编辑 王 勇〕

Progress on serum-free media of zooblast

SHANG Yu, ZHANG Qiming, LI Yue, WANG Yingbing

(College of Life Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China)

With the expanding scale, efficiency and safety requirements during mammalian cell culture in biomedical industry and research of life sciences, development of serum-free media (SFM) has become a major task in the field of cell engineering. The technology of SFM has experienced four stages including no serum source, no animal source, no proteins and chemically defined medium, and now reached to a status where SFM has more clear components and is easy-handling, allowing users to avoid the potential contaminants of pathogens from environment during cell culture, therefore, to bring a splendid progress and wide applications in the fundamental research of life sciences and bio-pharmaceutical industry. In this review, the classification, components and optimization of SFM were summarized, and latest applications in biological products, stem cells and cancer researches were briefly discussed. This will be helpful for the exploration of SFM in the research of biology, especially in the aspect of tumor stem cells.

serum free medium; biological products; cell culture

1672-4291(2015)04-0068-05

10.15983/j.cnki.jsnu.2015.04.344

2015-03-20

高等学校博士学科点专项科研基金(20120003120025)；中央高校基本科研业务费专项资金(2013NT31)；国家自然科学基金(81301701)

商瑜，女，讲师,博士,主要从事肿瘤细胞生物学及抗癌药物开发等研究。E-mail: shangyu@bnu.edu.cn

Q81

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