肝细胞癌循环肿瘤细胞标志物及检测方法研究进展

王姣姣, 耿圆圆, 张家耀, 姜 伟

1.中国农业大学生物学院, 农业生物技术国家重点实验室, 北京 100193;2.湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院肝胆外科, 湖北 恩施 445000

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种具有较高发病率及死亡率的恶性肿瘤，在中国肝细胞癌的死亡率仅次于胃癌和食道癌[1]。目前对于肝细胞癌的治疗以肝切除和肝移植为主，然而治疗效果不容乐观。临床上发现进行过肝移植的病人后期仍可能出现肿瘤的复发与转移，增加了临床上治疗的难度。肝细胞癌治疗术后5年复发率高达60%～70%，小肝细胞癌达43.5%，肝移植术后1年的复发率达50%～70%。出现这种现象的主要原因是脱落的肝癌细胞极易通过血液传播，在手术前肝细胞癌患者的血液中极可能已经有可转移的癌细胞存在，手术后存在于血液中的癌细胞可以重新回到原组织引发癌症[2]，这种被称为“self-seeding”的机制为患者术后治疗埋下了隐患。

1869年，澳大利亚学者Ashworth发现死于转移癌患者的血液中存在有一种与原发肿瘤相似的细胞，首次提出了循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)的概念[3]。由于某些自发的因素或手术过程中的操作，使位于实体瘤或转移灶中的某些细胞释放到外周血中，这些进入血液中的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞。CTCs是高度异质性的癌细胞群，根据CTCs中某些分子的变化可以确定肿瘤形成的根源，也可以追踪肿瘤转移过程中细胞免疫表型的变化等，为患者提供个性化的治疗方案[4,5]。目前认为，CTCs是恶性肿瘤进行远处转移的起始阶段，与患者的预后关系密切。肝癌细胞易于侵犯血管，在血管内或其他器官形成转移灶。对于肝细胞癌CTCs的研究已成为了解肝细胞癌转移复发机制的重点。然而CTCs在血液中含量甚微，约几亿个正常的细胞中才存在一个循环肿瘤细胞，这是由于进入外周血的大部分癌细胞在短时间内死亡，只有极少数活力高、转移力强的肿瘤细胞存活下来。因此收集并检测血液中含量极少的CTCs十分困难，需要敏感的检测方法和特异性的标志物。本文就用于检测CTCs的标志物及检测方法进行了综述，以期为肿瘤转移的早期检测等研究提供参考。

1 CTCs的标志物

正常的肝细胞转变为癌细胞后，癌细胞可以合成与之相关的多种蛋白质、多肽和酶类，相应的mRNA含量有所增加，这些物质对肝癌细胞具有一定的特异性，利用这些特异性物质可以检测血液中CTCs的存在。

1.1 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3, GPC3)

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3是硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族中的一员，通过糖基化的磷脂酰肌醇锚定在细胞质膜的外表面，参与细胞的迁移、增殖及调控细胞存活等[6]。GPC3在肝癌细胞内高度表达，在大部分非癌组织中基本不表达或表达水平极低。临床研究发现，在191位HCC患者中大约有74.8%的患者呈GPC3阳性，在154位非肿瘤患者中只有约3.2%的受试者呈GPC3阳性[7]。GPC3在卵巢癌、乳腺癌、间皮组织中的表达水平下调，暗示gpc3在这些器官中可能作为抑癌基因存在[8]。有研究发现，与正常肝组织和原发性肝损伤组织相比，在HCC中GPC3 mRNA水平和蛋白质水平有所上调，且随着肝细胞癌的恶性发展，其表达水平逐渐升高[7]。此外研究还发现GPC3的检测在甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)呈阴性的患者中也有较高的敏感性[9]。

1.2 转铁蛋白受体(transferrin receptor, TfR)

转铁蛋白受体(TfR)是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，能够与血清中的转铁蛋白相互作用维持机体铁离子的平衡，调节细胞的生长。TfR在正常的组织中表达水平较低，但却在癌细胞系，如肝细胞癌、胰腺癌、血癌、肺癌和乳腺癌等中高度表达[10]。其在癌细胞中的最高表达量较正常组织高出100倍，出现这种现象的原因可能是铁离子是DNA合成过程中核糖核苷酸还原酶的辅因子，TfR大量表达于癌细胞的表面，可以介导更多的铁离子进入细胞，参与DNA的合成[11]。目前临床上主要是将TfR的抗体连接上化疗药物、毒素蛋白等物质，通过细胞的内吞作用靶向治疗多种癌症。目前研究发现的TfR主要有两种：转铁蛋白受体1(TfR1)和转铁蛋白受体2(TfR2)。由于TfR在肝癌细胞中的表达水平较正常组织高，且表达程度与肿瘤的分级和阶段有关[12]，相对特异性较高，因此TfR被视为一种很有效的肝细胞癌肿瘤标志物。

1.3 甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)

1956年，Bergstrand 和Czar在进行人类胎儿血清蛋白电泳时发现了甲胎蛋白(AFP)[13]。AFP合成于胎儿的肝脏，在胚胎时期高度表达，出生18个月后其在血清中的含量迅速下降，而在正常的成人血液中含量甚少，但是研究发现在患有肝细胞癌、纤维性囊肿、慢性肝炎、肝硬化和其他癌症(如胃肠癌、胰腺癌和卵巢生殖细胞癌等)的病人血清中AFP的表达水平明显上调[14,15]。目前研究发现的AFP主要有AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3三种糖链异质体，其中以AFP-L3为标志物来检测HCC，可以使检测的特异性大于95%，所以AFP-L3被视为一种有效检测HCC的标志物；在慢性肝炎及肝硬化患者体内，利用AFP-L3能够检测到直径小于2 cm的肝肿瘤，能够提前9～12个月检测到肝硬化病人体内HCC的出现[16]。但是还没有相关研究表明AFP水平与HCC发展过程中CTCs的相互关系。通过RT-PCR方法检测血液中AFP mRNA的含量可以反映CTCs的存在，它是HCC胞外转移的敏感标志物。有实验表明，在40%的HCC患者及18%的非HCC患者体内检测到AFP mRNA呈阳性，且血液中AFP mRNA的水平明显与肿瘤的大小、血管入侵及HCC的分化程度密切相关[17]。但也有研究表明在慢性乙型肝炎、肝硬化，甚至健康组织中也可以检测到AFP mRNA呈阳性[18]。

1.4 α-L岩藻糖苷酶 (α-L-fucosidase, AFU)

α-L岩藻糖苷酶是存在于所有哺乳动物细胞内的一种溶酶体酶，参与多种岩藻糖复合物的降解过程[19]。有研究报道AFU在慢性肝硬化及HCC中表达上调，之后其成为一种有效的肿瘤标志物[20]。有研究表明在76.6%的原发性肝细胞癌中，AFU的表达水平明显增加，其含量与肿瘤的瘤淋巴结转移(tumor node metastasis，TNM)的阶段有关，表明AFU在检测原发性肝细胞癌方面起着重要作用[21]。还有研究表明AFU的表达在HCC患者体内明显上调，其检测的敏感性和特异性分别为72%和78%[22]；此外还发现在低表达AFP的肝细胞癌患者体内AFU阳性率为81.8%，在高度表达AFP的肝细胞癌患者体内AFU的阳性率为93.9%，因此血清中的AFU成为一种有效的HCC标志物，且在低表达AFP的HCC呈阴性的患者体内也有较高的检出率[23]。

1.5 上皮细胞粘附因子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)

上皮细胞粘附因子属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，是一种肿瘤相关蛋白，在胚胎时期高度表达，并且表达水平随发育过程而发生改变，在细胞间粘附、形态建成、细胞增殖分化方面发挥重要作用。有研究表明EpCAM从8周开始在肝前体细胞中呈阳性表达，而在成熟的肝细胞中EpCAM通常不表达[24]；在大约45.3%的HCC患者中EpCAM呈高度表达状态[25]，此外在食管癌、胃腺癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌等癌症中均呈阳性表达。尽管EpCAM是一种上皮细胞特异性的粘附分子，广泛地表达于上皮细胞及上皮细胞起源的肿瘤细胞表面，但是其在上皮间质转化过程中的表达量会有所下调[26]。基于检测EpCAM的方法可能会产生假阴性的结果；而一些上皮细胞也可以因操作过程进入外周血中，产生假阳性的结果。

1.6 高尔基蛋白73(golgi protein, GP73)

高尔基蛋白73，又称为Ⅱ型高尔基体 (golgi phosphoprotein 2, GOLPH2)，是位于高尔基体顺面膜囊上的上皮细胞特异性膜蛋白[27]。研究表明GP73主要表达于正常肝组织的胆管上皮细胞，而在正常肝细胞中表达量很低或基本不表达；但是在一些慢性疾病如肝炎及肝硬化，尤其是HCC中的表达水平明显上调[28～30]。同时研究表明GP73的表达水平与年龄、性别、HBV感染、肝外转移、肿瘤大小及数量无关[31]，因此GP73是一种潜在的有效检测HCC的标志物。有研究表明,与HCC的有效标志物AFP相比，GP73检测HCC的敏感性(76%)明显高于AFP(70%)，但GP73的特异性(86%)要低于AFP(89%)[32]。

1.7 异常凝血酶原(des-gamma-carboxy prothrombin, DCP)

异常凝血酶原又称为PIVKA-Ⅱ (prothrombin induced by vitamin K absence-Ⅱ)。正常的凝血酶原在肝脏合成后，由维生素K依赖性的羧化酶进行翻译后修饰，即将凝血酶原N-末端10个谷氨酸残基转化为γ-羧基谷氨酸残基，而DCP是由于机体在缺乏维生素K的情况下不能进行羧基化作用而产生不正常的凝血酶原，因此它不具备凝血活性[33]。1984年， Liebman等[34]首次报道了DCP检测HCC的有效性，之后DCP就被广泛作为一种有效的肝细胞癌肿瘤标志物用于临床研究。有研究表明DCP作为肿瘤标志物用来检测HCC的敏感性及特异性分别为40%～54%和81%～98%[35]。此外有报道表明AFP与DCP两者之间并无相关性，将两者结合使用来检测HCC，可以使检测的敏感性由单独使用AFP的28.7%～54.9%增加至63.4%～78%[36]。

2 CTCs的检测

随着科学技术的发展，目前用于检测CTCs的方法有很多种，而检测CTCs的方法主要涉及两个过程：CTCs的富集和CTCs的检测。由于CTCs在外周血中的含量甚少，为了提高检测的灵敏性，通常会先对CTCs进行富集。从血液中富集含量较少的CTCs的方法一方面包括依据细胞的物理化学等特性进行富集的非特异性方法；另一方面包括依据细胞本身及细胞表面的标志物等特性进行的特异性富集方法[37]。而CTCs的检测主要依据细胞本身的形态学特征及其存在的标志物来发现CTCs。每种方法都有其局限性，目前临床上通常综合运用多种方法来克服每种方法的局限性。

2.1 非特异性富集方法

2.1.1密度梯度离心法 目前常用于分离CTCs的商品化的分离液为聚蔗糖(ficoll)-泛影钠[38]。该方法分离细胞的原理是血液中各种细胞具有不同的密度，通过离心可将它们进行分离，从而达到富集CTCs的目的。将血液样品直接放置于密度梯度材料上，离心后自下而上分别为红细胞、中性粒细胞、单核细胞(上皮细胞、淋巴细胞、肿瘤细胞)。值得注意的是血液样品易与分离液混合，妨碍目的细胞的分离，从而影响富集效果。OncoQuick是在Ficoll基础上建立的一种可以有效防止血液样品与分离液混合的分离目的细胞的方法[39]，其使用50 mL的专用锥形离心管，内部设计有多孔筛，离心前将血液样品放置于多孔筛上，避免了样品与分离液的混杂。实验表明使用OncoQuick、Ficoll方法可以使血液中肿瘤细胞的回收率达到70%～90%[39]。在对富集的肿瘤细胞进行检测后发现OncoQuick分离法比Ficoll分离法具有更高的回收率且更容易从血液中富集到肿瘤细胞，使一些后续试验如细胞的染色、免疫标记和分子研究更加容易进行[40]。密度梯度离心法的优点在于其可以在不破坏细胞完整形态的基础上分离目的细胞，不影响后续实验；其缺点是在分离的过程中会丧失一部分目的细胞，缺乏特异性及敏感性[41]。

2.1.2依据细胞大小的膜过滤法 基于外周血中大部分的血细胞较肿瘤细胞小，可以通过一定孔径的聚碳酸酯膜将肿瘤细胞进行分离的一种非特异性的方法，ISET(the isolation by size of epithelial tumor cells)是目前常用的一种膜过滤法。该方法既不要求功能修饰也不需要复杂的富集程序，通过直径为8 μm的滤膜可以有效地富集外周血中的肿瘤细胞[42]。用ISET分离到的CTCs具有明显的细胞病理学特征，而又因为细胞的形态保留，通过细胞染色及细胞病理学检测，很容易区分肿瘤细胞及非肿瘤的上皮细胞，但是这种方法仍然会出现假阳性和假阴性的结果；此外又无研究表明所有肿瘤细胞的直径都大于8 μm，也无法排除直径大于8 μm的血细胞的存在，对其结果需进一步分析[1]。此方法操作简便，在不破坏细胞形态的基础上对细胞进行富集，对收集到的细胞通过细胞染色、免疫标记、FISH等实验来分析它们的抗原性、异倍体性和细胞凋亡的速率等。

2.2 特异性富集方法

免疫磁性分离法，即通过构建的磁珠-抗体来特异性地识别目的抗原，形成“磁珠-抗靶目标抗体-靶目标”复合物，在外加磁场的作用下，将靶目标从样品中分离出来用于随后的实验分析的一种技术。据报道目前商业用筛选靶目标的磁珠有两种，即阳性筛选磁珠和阴性筛选磁珠[43]，阳性筛选是将抗靶目标细胞的抗体包被于磁珠上，通过特异性识别靶目标将目的细胞进行分离，此筛选效率受靶细胞抗原表达水平的影响，CTCs由于肿瘤细胞的异质性而不表达某种特异性标志物，易造成假阴性的结果[44]，此外通过上皮细胞特异性抗体筛选CTCs可标记非肿瘤的上皮细胞，造成假阳性的结果；阴性筛选通过运用抗CD-45抗体排除血液中大多数白细胞的干扰[45]。该技术是一种特异性较强、操作简单且有效分离靶目标的方法。被分离的CTCs保持了细胞的完整性，有利于CTCs的记数、免疫细胞化学试验和免疫荧光试验等的进行。

2.3 CTCs的检测方法

2.3.1cellsearch系统检测 它是唯一受FDA认可的集筛选与检测为一体的自动化检测系统，广泛用于检测前列腺癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌患者外周血中的CTCs[46]。大多数肿瘤细胞都表达上皮细胞特异性表面抗原EpCAM，cellsearch 系统就是通过包被有抗EpCAM的特异性抗体的纳米磁颗粒在磁性区域捕获CTCs，通过三重染色过程使CTCs区别于血细胞，包括用荧光素标记CD45的抗体来标记白细胞，用荧光素标记角蛋白(CK)的抗体来标记CTCs及用DAPI对细胞核进行染色，并将CD45呈阴性、CK呈阳性、EpCAM呈阳性的细胞定义为CTCs。该方法的优点在于回收效率可达82%以上，是国际上认为最可靠的检测CTCs的系统，但该系统无法检测到表达特异性上皮细胞抗原水平较低及不表达的CTCs[47]，会造成假阴性的结果，此外富集到的CTCs为死细胞，无法回收进行下一步培养。

2.3.2流式细胞术(flow cytometry) 它是一种基于荧光激活细胞分选(FACS)技术的细胞分析及分选技术，其原理是通过荧光素与特异性的肿瘤细胞抗体结合，使靶细胞带上荧光素信号，然后通过流式细胞仪进行分析及分选。与免疫组织化学法及RT-PCR相比，流式细胞术不但能够给出高度精确的数据结果及细胞亚群的信息，而且还能够测定细胞的形态、放大免疫、鉴定细胞抗原性及快速地分析单个细胞，但其检测的效率依赖于细胞的数目，且价格昂贵、耗时长[48]。

2.3.3逆转录聚合酶链式反应(reverse-transcriptase PCR，RT-PCR) 它是一种通过检测肿瘤细胞特异性表达的mRNA水平来判断目的细胞存在与否的方法。由于肿瘤上皮特异性或组织特异性标记物的mRNA在外周血细胞中不表达，因此通过检测进入血液中的肿瘤细胞的特定mRNA表达量来间接反映CTCs的存在情况[37]。该技术主要是将肿瘤特异性的mRNA逆转录形成cDNA，通过cDNA基因扩增后对产物进行分析。其优点在于用该方法检测到CTCs的敏感性要比免疫介导的检测方法和细胞化学检测的敏感性高很多[49]；如果某个靶基因是典型的上皮细胞表达基因，由于一些操作原因会造成血液中出现非肿瘤的上皮细胞，造成假阳性结果[50]。

2.3.4CTC-chip 它是最近研发的一种具有创造性的技术，基于微流体技术来有效地、可重复性地分离上皮肿瘤患者血液中罕见的CTCs[51]。第一代CTC芯片是在一张尺寸大小与标准载玻片相当的硅片上覆盖几万个显微位点，每一个位点通过化学作用结合上抗EpCAM的抗体，依靠抗原与抗体之间的特异性捕获CTCs。CTC芯片在检测直肠癌、乳腺癌、肺癌和胰腺癌的敏感性可以达到99.1%，特异性可达100%[37]；但这种设计不但制造上有难度，而且价格昂贵。随后马萨诸塞州总医院的研究人员研发出了第二代CTC芯片，命名为HB芯片。第二代的HB芯片通过将显微位点设计成腓骨状，增大了肿瘤细胞与抗体的接触几率，使肿瘤细胞的捕捉效率更高，获得的结果更加全面可靠[52]。研究人员表明，HB芯片捕获CTCs的效率相比第一代芯片提高了25%，可捕获血液样品中超过90%的肿瘤细胞[52]。

2.3.5酶联免疫上皮斑点法(enzyme-linked epithelial immunospot assay, ELISPOT) 该技术是在酶联免疫吸附技术基础上发展的一种检测CTCs的方法，能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。其原理是根据细胞可以特异性分泌某种蛋白，与连有荧光的抗体特异性结合后通过荧光检测可确定是否存在目的细胞。使用此方法需要先去除CD45呈阳性的细胞，对肿瘤转移相关蛋白呈阳性的细胞进行富集[53]，从而对分泌特异性蛋白的 CTCs进一步检测，但这种方法目前还没有进行大量的临床试验[52]。

2.3.6免疫细胞化学法(immunocytochemistry，ICC) 该技术是将免疫学与细胞化学相结合所构建的新技术，即将连有荧光素的特异性抗体与肿瘤细胞表面的特异性标记物相互作用，利用荧光的强弱对其目标物进行定性和定量的检测。其优点在于可以分析细胞的大小及形态，但该方法敏感性较低，在临床上应用较少。在其基础上发展起来的激光扫描细胞计量技术(laser scanning cytomey，LSC)可以对荧光显微镜下的图像进行连续的扫描，并通过自动分析生成数据[54]。此方法具有高敏感、高分辨率的特点。同时可定性、定量及定位分析细胞内微结构。

3 展望

CTCs在肝细胞癌的复发转移中发挥着重要作用，但要进一步的研究CTCs及肝细胞癌的复发转移机制，首先需要从血液中检测出CTCs。虽然这方面的研究已经呈现出良好的趋势，但仍然面临许多困难，如血液中CTCs的含量极其微少，分离困难；缺乏检测CTCs的特异性标志物及目前检测CTCs的方法存在一定的局限性等，所以迫切需要找到一种更有效的检测CTCs的方法。而作为新型纳米颗粒材料的磁小体可以通过偶联抗体来检测肝肿瘤细胞，该技术是一种新颖的检测方法，可能将检测的灵敏度提高到新的水平，根据CTCs的检测结果合理选择治疗方案、根据CTCs变化主动调整治疗方案，并进一步研究肝细胞癌CTCs的生物学特性，为肝细胞癌转移及复发机制的深入研究奠定基础，具有较好的应用前景。

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