表面增强拉曼光谱在食源性致病菌检测中的应用

曹伟丽，汪崇文，肖瑞，王升启1，

1.安徽医科大学，安徽 合肥 230031；2.军事医学科学院 放射与辐射医学研究所，北京 100850

食源性致病菌污染引起的疾病已成为世界范围内举足轻重的公共卫生问题。据报道，美国每年有7600万人身患食源性疾病，有5000致死病例；据2000年的报道，英国有130万人患食源性疾病，有480个致死病例[1]。2006～2010年，我国卫生机构共收到食源性疾病暴发事件报告2023起，累计发病62920人，死亡967人，其中致病菌引起的食源性疾病暴发事件数和患者数最多，分别占40.09%和61.92%[2]。它不但危及消费者健康和生命，而且对个人、单位和社会造成不同程度的经济损失，包括医疗费用、致残而失业、劳动能力下降等。最常规最经典的检测方法如铺板培养法[3]、生化检测[4]等，操作过程较为繁琐，而且非常耗时，难以满足食源性疾病预防控制的需要。如何快速灵敏地检测出食源性致病菌的存在，已成为控制食品安全问题的关键。

利用振动光谱如红外光谱、拉曼光谱等技术检测食源性致病菌早有研究。但红外光谱对水非常敏感，不能充分发挥其检测优势。拉曼光谱依赖于激发光的非弹性散射和分子间的振动产生指纹图谱，以此来鉴别特定的待检分子，具有快速检测多种化学、生物物质的能力，是一种可实时检测的方法。而且水的拉曼效应很弱，这使得拉曼光谱对水环境中的生物样品检测非常有效，另外拉曼特征峰比红外特征峰要窄，拉曼光谱在较广范围的激光波长下能够提供比红外光谱更加具体和更易解读的生物和化学信息。拉曼光谱的这些优点使其常被用于微生物的检测和表征[5-9]。但普通拉曼光谱信号弱，检测灵敏度低，限制了其在食源性致病菌检测中的发展。

表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）以金属纳米结构介导信号增强，相比普通拉曼光谱具有更高的分辨率和灵敏度，可实现高达1014倍的单分子拉曼信号增强，在低浓度分析物的检测上更加有优势[10-11]。它是一种高灵敏的拉曼检测技术，具体是指在特殊制备的一些贵金属表面或溶胶中，由于样品表面或近表面的电磁场的增强导致吸附分子的拉曼散射信号比普通拉曼散射信号大大增强（6～14个数量级）的现象。SERS能有效避免溶液相中相同物质的信号干扰，具有极高的灵敏度和表面选择性，能获得高质量的表面拉曼信号。SERS效应被发现后，很快在生物、医学、材料、环境等方面得到广泛应用[12-14]。我们对目前国内外食源性致病菌的SERS检测方法进行归纳和综述，并对不同方法的优缺点进行阐述和分析。

1 食源性致病菌菌体检测

1.1 无标记菌体检测

无标记的SERS菌体检测方法由于不需要特殊的检测标记物如染料分子或化学发光分子等，检测过程简单快速。

1.1.1 纳米金属胶体菌体检测 研究者大多通过不同大小的AuNP、AgNP等纳米颗粒或由无机盐诱导的纳米颗粒团聚体作为SERS增强基底，简单地与食源性致病菌混合而获得其拉曼光谱。吕璞等[15]以整个大肠杆菌和志贺菌为研究对象，通过菌体与纳米银胶体混合均匀后滴于硅基底上，利用拉曼光谱仪检测其拉曼信号来区分大肠杆菌和志贺菌。结果表明，未与纳米银颗粒混合的大肠杆菌和志贺菌没有明显的拉曼信号，而与纳米银颗粒混合后有明显的拉曼信号，二者有明显的区别，且重现性良好。苏永波等[16]用便携式拉曼光谱仪获得了金黄色葡萄球菌、变形杆菌、大肠杆菌在微波法制备的纳米银溶胶上的表面增强拉曼光谱。3种细菌的拉曼振动峰的位置和强度区别明显，因此SERS技术可用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和变形杆菌的快速鉴别。根据SERS的增强效应，黄玉坤等[17]制备金纳米溶胶作为增强试剂，采用36种不同的病原菌随机编号作为未知样品进行拉曼光谱扫描检测，通过聚类分析达到种属鉴别，初步建立了病原菌SERS快速鉴别方法。

Senguptaa等[18]以纳米银胶体为SERS基底，对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门菌进行了鉴别，并通过对含有N-乙酰基的氨基葡萄糖和带氨基的L-赖氨酸、D-丙氨酸、D-谷氨酸进行检测，初步分析了致病菌拉曼峰归属问题。Wang等[19]在96孔板中以50 nm AuNP为SERS基底，通过与菌体混合、短暂培养，5 min内检测菌体的拉曼信号，所得数据用PCA、HCA软件分析后，对7种不同的致病菌进行了区分归类。Yao[20]以AuNP为SERS基底，对9种致病菌进行了SERS检测，PCA和HCA分析实现了归类。SERS技术与数学分析方法结合，增强了其检测食源性病原菌的实用性及灵敏性，应用潜力很大。

为了提高菌体检测的灵敏度及重复性，杨丹婷等[21]以大肠杆菌DSM株为检测模型、胶体银为液态基底，通过优化培养条件（振荡速度、培养时间、培养温度），选取较优条件对培养的大肠杆菌进行检测。DSM 1116在制备的AgNP溶液中于37℃、100 r/min振荡培养3 h为获得SER检测的较优培养条件。以此条件，通过对检测结果归一化处理，对大肠杆菌DSM 498/1116/5695进行了鉴别。另外还检测出单个大肠杆菌的拉曼峰，其出峰位置与溶液中细菌的出峰位置相同。通过SERS成像技术能够检测到大肠杆菌的最低浓度为1×105/mL。这种在胶体银中培养后检测的方法比未培养的检测方法的拉曼信号强度提高到3.5倍，灵敏度和重复性也得到提升。

上述以金属胶体为SERS基底检测致病菌的方法简单、快速、成本低，不需要特殊装备，但结果重复性差。纳米颗粒与细菌的混合溶液往往不均一[22]，金属胶体的形状、大小的微小变化都可以改变其SERS增强因子，且纳米颗粒与致病菌细胞壁之间不充分的结合常常得不到重复性好的拉曼光谱，这在一定程度上限制了SERS技术的应用。

1.1.2 固态基底菌体检测 为了提高SERS检测致病菌方法的重复性，很多研究者研制固态基底对致病菌进行检测。2009年，波士顿大学的Yan等[23]通过在电场力作用下，以10 nm Au和40 nm Au自组装制备固态基底，对大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌进行了检测。通过多元方差、NCAS等对数据进行分析，实现了对这3种菌的鉴别。

Zhao[24]带领他的团队利用斜角沉积技术，用专门设计的电子波束蒸镀系统制备了银基底。他们使用便携式和手持式拉曼光谱仪，以万古霉素修饰的银基底检测了致病菌。纯菌体样本的最低检测限为102CFU/mL，绿豆芽样本的最低检测限为103CFU/mL。另外，该课题组结合数学分析方法，通过主成分分析，对不同菌株进行了区分，整个实验周期少于4 h。这种方法提供了SERS检测微量食源性致病菌的有力平台，同时具有在实际环境中应用的潜力，为SERS技术的推广应用打下良好的基础。

1.2 抗体标记法菌体检测

1.2.1 单组抗体标记检测 2010年，Wigginton等[25]通过胶体金标记一组抗体的方法得到待测菌的拉曼信号。他们将含有致病菌的样品用膜滤器过滤，并捕获在膜的顶部；以40 nm胶体金标记抗体，与待检溶液孵育30 min。标记抗体的胶体金与待检菌特异性结合，然后通过PCTE膜过滤，清洗后，未与抗体结合的致病菌被洗掉，结合了胶体金的待检菌通过拉曼成像检测。这种方法检测特异性高，能从含有多种菌体的样本中分离出待检菌。但是由于蛋白质的空间位阻，使得胶体金与待检菌距离加大，其SERS增强作用减弱，使得检测灵敏度较低。

1.2.2 双组抗体标记检测 为提高检测灵敏度，许多研究采用抗体-抗原-抗体夹心法结合SRRS技术检测致病菌。首先拉曼复合物偶联抗体后特异性捕获样品中的致病菌，然后与连有抗体的液态基底结合，拉曼光谱仪检测拉曼信号。在利用SERS抗原抗体夹心法检测致病菌方面，Wang、Guven等做了很多研究，并取得了一定的成果。Wang等以二氧化硅包裹顺磁性纳米颗粒Fe3O4为液态基底、纳米Au-MBA为拉曼复合物，检测了花生液中的3种致病菌，最低检测限为103CFU/mL[26]。Guven等以棒状金胶体结合DTNB为拉曼复合物、金包裹顺磁性纳米颗粒Fe3O4为液态基底，检测DTNB的拉曼信号。检测了浓度为101～107CFU/mL的大肠杆菌，在4.7×101～4.7×104CFU/mL范围内拉曼信号强度与菌体浓度有良好的线性关系，R2为0.992。最低检测限（LOD）为8 CFU/mL，定量限（LOQ）为24 CFU/mL[27]。这种方法基于抗原抗体免疫反应，特异性好；同时由于拉曼标志物的信号较菌体本身信号强，在外加磁场作用下纳米颗粒Fe3O4对待检物进行有效富集，故可获得较高的检测灵敏度。但是由于需要能特异性与致病菌反应的一对抗体，这种方法的检测成本较高，偶联抗体等步骤使得前期实验过程繁琐，且由于蛋白存放周期的限制，其应用有效期较短，且偶联抗体后的拉曼复合物稳定性仍有待提高。

2 食源性致病菌标记物检测

吡啶二羧酸（DPA）是致病菌的休眠体-芽孢中特有的生物标记物。通过检测DPA，可实现对致病菌芽孢的检测[28]。2009年，Cheng等[29]利用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）修饰金基底，然后在PVP上面修饰一层金纳米颗粒作为SERS基底检测DPA，最低检测限为0.1×10-9mol/L，而且在低浓度范围内DPA的拉曼信号强度和它的浓度之间呈线性相关。该发现为建立高灵敏度的基于SERS对致病菌孢子生物标志物进行识别的技术提供了很好的研究基础。2年后，该课题组利用金纳米颗粒作为SERS基底检测枯草芽孢杆菌孢子释放的DPA[30]。该方法让SERS检测致病菌孢子具有更高的分辨率和灵敏性。2013年，Cowcher小组[31]以银纳米溶胶作为SERS基底，结合数学分析方法，建立了一套便携式快速检测病菌的检测系统，可检测5×10-9DPA。

与直接检测完整菌体相比，检测致病菌孢子标记物具有更高的分辨率和灵敏性，这在检测环境中是否存在致病菌时具有很好的实用性。但是由于DPA是致病菌孢子中共有的物质，所以通过检测DPA无法实现对不同菌株的鉴别与区分。

3 食源性致病菌核酸检测

2010年韩国的Kang等[32]以4种致病菌的目的DNA片段为待检物，设计了2条与目的DNA片段互补配对的DNA探针，将其中一条通过巯基固定在普通硅基底上作为捕获探针，用拉曼染料、AuNP与另一条DNA序列相连作为检测探针，其中AuNP起SERS增强作用，增强因子为2.6×103。该方法的最低检测浓度为10 pmol/L。

这种检测方法灵敏度很高，但在实际应用中可行性不高。首先，须从菌体中提取核酸，样品前处理过程繁琐；其次，基于SERS检测食源性致病菌核酸的主要工作是制作与目标寡核苷酸互补的检测寡核苷酸探针和捕获寡核苷酸探针，而设计探针需要目的DNA片段的碱基序列，这就限制了此方法的实际应用，且偶联核酸等实验过程较为繁琐，周期较长。

4 SERS与其他技术联用

SERS与其他技术连用，是为了取长补短，实现致病菌检测方法的优化。2003年，Alexander等[33]采用近红外-SERS获得单一细菌孢子的拉曼光谱。他们把60 nm AuNP修饰在玻璃上作为SERS基底，在787 nm激光激发下，对嗜热芽孢杆菌的2种不同菌株的单个孢子进行了检测，与传统拉曼光谱相比，灵敏度增强了102。

5 结语

由于食源性致病菌在数百万细菌中只占很少的一部分（＜100 CFU/g），尤其当它们浓度较低时，很难被检测出来[34]。这就需要开发稳定、可靠、快速、灵敏、有选择性及成本可行的检测技术。这种检测技术应该能够适合实时监测，以满足实际应用中食源性疾病预防控制的需要。根据SERS技术的理论及应用实践，人们已建立了很多快速、简便、特异、敏感、低耗的SERS检测技术。但是，目前仍未能实现SERS检测技术的产品化与广泛推广应用，各项研究仍须进一步完善与优化。

近年来SERS技术发展迅速，随着微加工技术和纳米技术的进步，拉曼光谱仪将不断微型化，各种便携式、手持式拉曼光谱仪的出现，使在市场上直接检测食源性致病菌成为可能。拉曼光谱仪还将进一步提高与计算机的紧密结合，样本信息采集、数据处理、分析连续完成，形成检测的自动化系统。SERS技术的不断进步，必然会要求不断降低检测成本，提高灵敏度、稳定性，这些特性的改善也会加速这项致病菌检测技术的市场化、商品化应用进程。

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