鼠疫耶尔森菌F1-V 融合蛋白改构体的构建、原核表达及纯化

房婷，尹可欣，任军，张晓鹏，于蕊，宋小红，杨秀旭，于长明

军事医学科学院科学院 生物工程研究所，北京 100071

鼠疫也称黑死病，是由鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）引起的烈性传染病，主要的寄主和传染源为啮齿类动物[1]。感染鼠疫菌主要有3 种类型，即腺鼠疫、肺鼠疫和败血症鼠疫。其中肺鼠疫病程急、致死率高，肺鼠疫患者咳嗽产生的带菌飞沫可经呼吸道途径发生人-人传播，导致更加严重的人间鼠疫[2-4]。

进入20世纪90年代后，鼠疫疫情逐渐活跃的趋势更加明显，鼠疫被WHO 确定为重新流行的20 种传染病之一。鼠疫治疗目前以抗生素治疗为主，虽早期给予足量抗生素的治疗效果良好，但副作用较大，且已发现耐药鼠疫菌菌株[3,5]。因此，鼠疫的预防成为关键，研究鼠疫疫苗具有重要意义。传统鼠疫疫苗有全菌体灭活疫苗（如美国使用的鼠疫USP 死菌苗）及减毒活疫苗（如中国和其他几个国家正在使用的EV76 减毒活疫苗）等，但上述疫苗存在副作用大、免疫次数多、保护时间短，且无法防护通过气溶胶传播的肺鼠疫等一系列问题[6-7]。而重组亚单位疫苗克服了传统疫苗的许多缺陷，不含感染组分，无致病性，且具有在体内不复制的优点，因此，亚单位疫苗成为当前鼠疫疫苗研究的热点。目前鼠疫亚单位疫苗主要有以下4 种形式：F1 荚膜抗原（F1 抗原）、V抗原、以一定比例混合的F1抗原+V抗原、F1-V融合蛋白，其中后者不仅可以有效防护腺鼠疫，而且可以有效阻止肺鼠疫的发生[8-12]。

上述疫苗最大的问题在于，F1 的天然功能是其在鼠疫菌外膜聚集成寡聚蛋白，形成胶样颗粒层、水溶性的荚膜物质。这种天然属性会造成其易于形成不均一的聚集体。虽然无论是完整形式的F1 聚合体还是F1 解聚后的单体都具有免疫原性，但这会为疫苗生产的质量控制带来问题[13-15]。而且用F1和V构建的融合蛋白重组F1-V（rF1-V）也无法避免目的蛋白的无规则聚集，导致纯化后的rF1-V 相对分子质量从53 061 到1.5×107间均有分布[11]。在本研究中，我们根据F1 的结构特点对其序列进行改构，将N 端1～14位氨基酸移到C 端，再将其与V 蛋白融合，形成稳定、均一的单体形式融合蛋白，鉴定正确后，使之在大肠杆菌中高效表达，然后摸索了纯化方法，并对纯化产物进行了检测。

1 材料与方法

1.1 材料

感受态大肠杆菌Top10、BL21（DE3）购自天根公司；质粒pET-32a（+）购自Novagen 公司，pET42a-VF1 为本室保存；限制性内切酶购自NEB 公司；Pyrobest DNA 聚合酶、ExTaqDNA 聚合酶、T4DNA 连接酶等购自TaKaRa 公司；质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒购自Qiagen 公司；PageRuler Prestained Protein Ladder 购 自Thermo 公 司；蛋 白marker 购自北京全式金生物技术有限公司；离子交换填料Source30 Q、疏水填料Phenyl Sepharose High Performance（装于XK 26/20 柱壳）、凝胶过滤预装柱HiLoad 26/60 Superdex 75 prep grade 均购自GE Healthcare 公司；抗小鼠IgG-HRP 为Santa Cruze公司产品；细菌内毒素标准品购自厦门鲎试剂实验厂有限公司；氨苄西林（Amp）为华北制药厂产品；抗V和抗F1单克隆抗体购自Abcam公司。

低温高速离心机购自Beckman Coulter 公司；SDS-PAGE 电泳仪为BIO-RAD 公司产品；Image Quant LAS4000mini 成像系统和纯化仪AKTA EXPLORER均为GE Healthcare公司产品；酶标仪Spectra Max Paradigm 为Molecular Devices公司产品。

1.2 目的基因的PCR扩增及产物纯化

引物设计见表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以pET42a-VF1 为模板，PCR 分别扩增V及F1mut片段。第一轮PCR 用引物F1mutF1和F1mutR1，去掉F1 分子N 端的1～14 位氨基酸对应的碱基序列，并在核酸序列的5'端引入NdeⅠ酶切位点，得到F1mut1；用引物VF和VR，在V基因序列的5'端引入BamHⅠ酶切位点，3'端引入终止密码子和NotⅠ酶切位点，得到V序列。第二轮PCR 用引物F1mutF1、F1mutR2，以F1mut1为模板，在其3'端引入F1 分子N 端1～14 位氨基酸对应的碱基序列，用SA 连接，得到F1mut2序列。第三轮PCR 用引物F1mutF1、F1mutR3，以F1mut2为模板，在其3'端引入F1 分子N 端15～21 位氨基酸对应的碱基序列和BamHⅠ酶切位点，最终得到F1mut片段。PCR 产物经10 g/L 琼脂糖凝胶电泳分析，并用琼脂糖凝胶DNA回收纯化试剂盒纯化。

1.3 表达载体的构建及鉴定

将纯化的PCR 产物首先进行加A 反应，将加A产物与pMD18-T 连接后，转化大肠杆菌TOP10 感受态细胞，37℃培养，用菌落PCR 鉴定重组质粒，阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司进行DNA测序分析。

将测序正确的质粒pMD18-T-F1mut和pMD18-T-V 分别用NdeⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/NotⅠ双酶切，片段回收后与pET-32a 载体连接转化，37℃培养，挑取单菌落，菌落PCR 鉴定，将阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司进行DNA 测序分析，测序正确的阳性pET-32a-F1mut-V 质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。

1.4 rF1mut-V的诱导表达

从平板上挑取获得的改构体工程菌的单菌落，接种于5 mL 含100 mg/mL Amp 的LB 培养液中，37℃、220 r/min培养12 h，次日以1∶100的比例转接到含Amp 的LB 培养液中，37℃、220 r/min 培养至对数生长中期（D600nm约为0.6），加入终浓度为50μmol/L 的IPTG，25℃诱导5 h，15% SDS-PAGE 鉴定诱导表达情况。

表1 引物及序列

1.5 分级硫酸铵沉淀

发酵料液于4℃、8000 r/min 离心10 min，弃上清，收集菌体沉淀，每克菌体加入10 mL 缓冲液A（50 mmol/L Tris，2 mmol/L EDTA，5%甘油，pH9.0）重悬，冰浴超声波破碎菌体，4℃、12 000 r/min 离心30 min，收集上清，加入终浓度为60%的硫酸铵，冰浴搅拌30 min，10 000 r/min 离心30 min，弃上清，沉淀用缓冲液A洗3次后重悬，用0.45μm的滤膜过滤后待用。

1.6 阴离子交换层析

采用Source 30Q 阴离子交换柱（XK26/20 柱体积CV=20 mL），用平衡缓冲液A 平衡后上样，继续用缓冲液A 淋洗至基线，再采用线性梯度30%B 10CV 洗脱，B 泵为缓冲液B（50 mmol/L Tris，1 mol/L NaCl，pH9.0），根据SDS-PAGE 收集合并目的蛋白组分，进入下一步纯化。

1.7 Phenyl疏水层析

收集液先用NaCl 母液（50 mmol/L Tris，4 mol/L NaCl，pH9.0）调节电导后，4℃、10 000 r/min 离心30 min。采用Phenyl HP 疏水交换柱（XK26/20柱体积CV=20 mL），用平衡缓冲液C（50 mmol/L Tris，2 mol/L NaCl，pH9.0）平衡后上样，继续用缓冲液C 淋洗至基线，再采用线性梯度100%B 10CV 洗脱，B 泵为缓冲液D（50 mmol/L Tris，pH9.0），根据SDSPAGE收集合并目的蛋白组分，进入下一步纯化。

1.8 凝胶过滤层析

采用凝胶过滤预装柱HiLoad 26/60 Superdex 75 prep grade（CV=318 mL），缓冲液为E（20 mmol/L PB，0.15 mol/L NaCl，pH7.2），将目的蛋白进行精纯的同时完成缓冲液的置换，根据SDS-PAGE 收集合并目的蛋白组分。

1.9 rF1mut-V的鉴定

将纯化的rF1mut-V，本室制备的重组F1、V 蛋白，没有改构的重组F1-V 蛋白分别加入5×SDSPAGE 加样缓冲液，100℃变性5 min，离心，行15%SDS-PAGE，电泳结束后转到硝酸纤维素膜上，化学发光法显色，用Image Quant LAS4000mini化学发光成像系统曝光。

非还原型SDS-PAGE 用于检测蛋白纯度，上样量为10μg，将SDS-PAGE 结果经扫描仪扫描后，用Bandscan软件分析纯度。内毒素测定采用凝胶限度试验，方法见2010 年版《中华人民共和国药典》三部附录ⅫE）。结果判定，凝固为内毒素阳性，未凝固为内毒素阴性。检测灵敏度为0.5 EU/mL。

2 结果

2.1 F1mut改构体三级结构模拟

将F1和F1mut 的序列提交到SWISS-MODEL服务器（http://swissmodel.expasy.org/），模拟结果见图1。由图1A、B可以看到F1的三级结构主要是由4个反向平行的β折叠形成类似三明治结构，疏水核心部分暴露在一个狭长的疏水深裂中。其中一个F1蛋白的3个β折叠形成上述缝隙，而另一个F1蛋白N端的β折叠作为“供体”嵌入该缝隙中，最终形成高分子量的线性F1 纤维结构。但该结构在形成过程中需要外膜引导蛋白Caf1A和伴侣蛋白Caf1M 的共同作用，引导F1 蛋白的正确折叠[16-18]。而在外源系统中过度表达F1 抗原时，由于缺失Caf1A和Caf1M，F1会形成不可控的聚集，并容易形成包涵体。

我们将N 端1～14 个氨基酸转移到C 端，以期单独的F1mut 蛋白即可形成上述三明治结构（图1C、D），因此在外源系统表达该蛋白时，不再需要Caf1A和Caf1M即可形成可溶的单体结构。

2.2 目的基因的PCR扩增

10 g/L 琼脂糖凝胶电泳表明扩增产物与F1mut及V基因大小相符，分别约为486和992 bp（图2）。

2.3 克隆载体pMD18-T-F1mut和pMD18-T-V 的菌落PCR鉴定

PCR 获取F1mut及V基因片段后，将其克隆到pMD18-T 载体中，转化大肠杆菌Top10，菌落PCR 鉴定，并对阳性克隆进行测序分析。结果表明阳性克隆的基因片段长度及测序结果与F1mut及V基因一致（图3、4）。

2.4 pET-32a-F1mut-V原核表达载体的构建及鉴定

图1 通过SWISS-MODEL预测的F1和F1mut的三级结构模型

pET-32a 双酶切载体片段依次与pMD18-TF1mut和pMD18-T-V 克隆载体的双酶切回收的基因片段（图5）连接，转化大肠杆菌Top10 感受态细胞，37℃培养后挑取单菌落培养，经菌落PCR 鉴定可看到部分克隆扩增到约1500 bp的目的条带（图6）。

2.5 rF1mut-V改构体的表达与纯化

将发酵液离心重悬后超声波裂解，离心收集上清、沉淀，等体积重悬。上清采用硫酸铵分级沉淀，在60%饱和硫酸铵时离心分离上清、沉淀，沉淀用上样缓冲液清洗后重悬，目的蛋白绝大部分被沉淀下来，纯度提高到60%以上（图7A），随后经Source 30Q、Phenyl HP和Superdex 75 三步层析柱纯化，目的蛋白纯度达95%以上。但目前经硫酸铵分级沉淀后发现仍然存在二聚体形式，经上述三步纯化，尤其是Superdex 75，可将单体和二聚体完全分开（图7D）。

2.6 rF1mut-V的初步鉴定

图2 PCR扩增F1mut1、F1mut2、F1mut及V基因

图3 pMD18-T-F1mut转化TOP10的菌落PCR鉴定

图4 pMD18-T-V转化TOP10的菌落PCR鉴定

将纯化后的蛋白分别进行纯度、浓度、内毒素检测和Western 印迹。Western 印迹使用本室制备的rF1、rV和未改构的rF1-V 抗原为阳性对照，结果表明rF1mut-V 抗原与抗V、F1 抗体均有特异性结合（图8）。同时将本室制备的rF1-V、rF1、rV和rF1mut-V 分别进行非还原和还原型SDS-PAGE（图9），发现rF1、rV和未改构的rF1-V 均有不同程度的聚集，尤其是rF1和rF1-V 的聚集体呈不均一分布，但都可被还原为均一的单体形式。相比于rF1-V，rF1mut-V 主要有单体和二聚体形式，且还原后相对分子质量与rF1-V 的单体一致。从图9 还可以看出rV 抗原在非还原状态下存在二聚体，由于rF1mut-V仅对F1 序列进行改构，而保留了天然V 抗原第273位的半胱氨酸位点，这会导致rF1mut-V 产生同V 抗原一样的分子间二硫键，从而形成同源二聚体[19]。

用Bandscan 软件分析非还原型SDS-PAGE 结果，纯度大于95%。内毒素含量检测表明阴性对照及各样品均为阴性，阳性对照为阳性。

3 讨论

目前鼠疫亚单位疫苗的主要候选抗原为F1 抗原、V 抗原、鼠疫菌外膜蛋白（Y.pestisouter membrane protein，Yops）和纤溶酶原激活物/凝固酶（plasminogen activator/coagulase，Pla）。其中，由英国PharmAthene UK Limited 研发的rF1+rV 疫苗、美国DynPort Vaccine Company LLC 研发的rF1-V 融合蛋白疫苗均已进入临床试验阶段（ClinicalTrials.gov Identifier：NCT00246467，NCT00332956），但目前还没有一种重组亚单位疫苗获批上市，这与之前描述的F1 抗原天然结构造成的缺陷不无关系，因为其会为产品质控和大规模生产带来巨大挑战。

图5 pMD18-T-F1mut和pMD18-T-V质粒的酶切鉴定

图6 pET-32a-F1mut-V转化Top10的菌落PCR鉴定

图7 rF1mut-V纯化过程分析图

图8 Western印迹图谱

本研究在基因水平上对F1 的结构进行改变，通过3轮PCR，将F1蛋白N端前14个氨基酸移到C端，然后将改构的F1mut 与V 蛋白融合表达，得到了序列正确且能够可溶表达的重组F1mut-V 融合蛋白，目的蛋白占全菌蛋白的25%以上。这为后期大规模生产奠定了良好基础，省却了繁琐且容易造成蛋白失活的变性-复性过程。经过硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析、疏水相互作用层析和凝胶过滤层析，分别得到了纯度符合要求的rF1mut-V 单体和二聚体。在纯化中，均采用商品化的层析填料，并且纯化流程衔接顺畅，不需要换液、稀释等中间步骤，便于操作和放大。并进行了Western印迹鉴定，证明融合蛋白与天然结构的rF1-V 一样，均与F1、V 抗原有特异性结合。但相比于rF1-V，改构后rF1mut-V 的性质更为稳定，不会发生如图9 所示的不规则聚集。虽然冻干、低温保存、加入还原剂等手段可以在生产重组F1-V融合蛋白的过程中抑制聚集的发生，但一旦盐浓度提高、温度改变剧烈或去除还原剂，不可控的聚集很快就会发生，甚至有可能会导致沉淀[11]。因此，rF1mut-V 有望成为新一代亚单位疫苗的有效成分。

图9 抗原的SDS-PAGE图谱

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