代谢组学在呼吸系统疾病研究中的应用进展

杜祥博，周宁，孙博，张琪，许美凤，颜贤忠

1.中南大学 药学院，湖南 长沙 410013；2.国家生物医学分析中心，北京 100850

随着生命科学的不断发展，人们关注的焦点开始转向系统生物学，作为系统生物学的组成部分，基因组学、蛋白质组学、转录组学和代谢组学等先后发展起来。无论机体在基因、蛋白质、转录层面发生什么变化，最终都会体现在代谢产物的变化上。可以说代谢组是对基因组、蛋白质组和转录组层面变化的一种“放大”，这种变化可以敏锐地体现在代谢产物的变化上，即反映机体在特定生理病理状态下的变化，从而为疾病的诊断提供新的研究思路。目前随着各组学学科的不断发展，代谢组学也成为研究热点之一，其在各个方面的应用日益深入，如毒理学、营养学、疾病诊断等。我们结合代谢组学概况，对其近年来在几种呼吸系统疾病相关生物标志物研究方面取得的进展进行简要综述。

1 代谢组学简介

代谢组学概念最早是由英国学者Nicholson等[1]在1999年基于核磁共振（NMR）分析的基础上首次提出的,并将其定义为通过分析生物体液和组织中内源性代谢产物、代谢组或代谢物图谱的变化来研究整体的生理状况，是现代生物医学的一个重要分支学科。随着生物医学分析技术的不断发展，人们对代谢组学的认识也不断深入，代谢组学研究就是要利用各种高通量的分析手段，对生物体液、细胞及其提取物和组织及其提取物进行系统分析，找出相关的生物标志物，阐述相关的代谢路径，对机体整体的状况和功能做出评价，进而探讨其应用于疾病诊断的可行性。常用的检测技术主要有核磁共振、色谱、气质联用（GC-MS）、液质联用（LC-MS）和毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）等。代谢组学的数据分析多采用模式识别技术，主要包括主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘法（OPLS-DA）等，结合代谢物数据库，挖掘出这些数据中蕴含的生物学信息，阐明其相关的代谢通路。

2 代谢组学在呼吸系统疾病研究中的应用

呼吸系统疾病一直是危害人体健康的常见疾病，哮喘、慢性阻塞性肺病、囊性纤维化、肺结核、肺癌等呼吸系统疾病的发病率都呈逐年上升趋势。随着我国工业化的不断深入，空气质量日益恶化，特别是近年来雾霾天气频繁出现，其对人体呼吸系统的危害日益严重，有关呼吸系统疾病的代谢组学研究已成为科研工作者关注和研究的热点之一。

2.1 哮喘

哮喘是人类常见的慢性呼吸系统疾病之一，易于反复发作，极大地降低患者生存质量，特别易发于儿童，近些年来已成为人们关注的全球性健康问题。尽管镜检是较为直接的检查方式，但镜检价格昂贵且病人生理上较难接受，因而寻找一种简单非侵袭性的诊断方式成为人们关注的问题。Sude等[2]收集了稳定型哮喘儿童患者、不稳定型哮喘儿童患者和健康儿童的尿液，采用NMR技术检测，结果分别找出23和28种潜在的生物标志物，并以其中的30种代谢物建立模型，能够将稳定型、不稳定型哮喘儿童与健康儿童区分开来。Mattarucchi等[3]采用LC-MS的代谢组学方法，对41例哮喘儿童和12例健康儿童的尿液进行检测分析，结果显示两者有较明显的分离趋势，相对于对照组，患者组尿液中乙酸盐、异亮氨酸-脯氨酸结构类似物排泄减少。上述研究均表明，基于尿液的代谢组学研究可为哮喘的诊断和分型提供较为可靠的方法。Gahleitner等[4]采用GC-MS技术研究哮喘患者和健康人的呼出气冷凝液，发现患者组呼出气冷凝液中1，4-二氯苯、2-辛烯醛、十八炔和乙酰胆碱等物质水平显著性升高。Ibrahim等[5]采用基于NMR的代谢组学技术研究哮喘病人和健康人的呼出气冷凝液，寻找两者间代谢物的显著性差异，但是通过82例哮喘患者和35例健康人的NMR数据分析并没有能够找出潜在的生物标志物。Jung等[6]则采用基于NMR的代谢组学技术研究了39例哮喘患者和26例健康志愿者的血浆样品，发现病人组组氨酸、谷氨酰胺等代谢物水平升高，乙酸、葡糖糖、胆碱等水平显著性升高。

Ho等[7]采用GC-MS和LC-MS技术结合的方法研究小鼠哮喘模型。研究结果显示，哮喘模型组和对照组的差异主要表现在碳水化合物和脂类物质的差异，如乳酸、肌酐等水平降低，半乳糖等水平升高；脂类中的磷脂酰胆碱、甘油三酯、胆固醇等代谢物水平升高。Ho等[8]将气质液质的代谢组学方法与多重细胞因子分析结合起来，结果发现在尘螨暴露环境中嗜酸性粒细胞增多，中性粒细胞和炎性细胞因子增加。总的来说，代谢组学较为全面地揭示了尘螨引起的过敏性哮喘的特异性变化。近期的研究将代谢组学和蛋白质组学方法结合起来，发现磷脂酰胆碱水平升高和溶血磷脂酰胆碱水平下降是哮喘的代表性代谢模式，同时也对之前的研究结果进行了验证和补充。

2.2 慢性阻塞性肺病（COPD）

COPD具有患病人数多、复发率高、死亡率高和治疗难度大的特点。据统计，COPD目前居全球死亡原因的第4位，预计到2020年COPD将上升到世界疾病经济负担的第5位，而我国COPD的发病率呈上升趋势，严重威胁人民身体健康。有证据显示COPD病人骨骼肌内能量代谢紊乱，为此Rodriguez等[9]收集了18例COPD患者和12例健康志愿者运动前后的血浆，用NMR检测后发现两者前后变化差异较大，正常人多种氨基酸、肌酐/肌酸、葡萄糖等代谢物表现出显著性的变化，而COPD患者在训练后只有乳酸水平的下降。该研究也证明代谢组学可以较好地表征COPD患者体内的变化。

Mcclay等[10]通过NMR的代谢组学方法，研究了195例健康人和197例COPD患者的血浆和尿液小分子代谢物谱，结果显示尿液代谢物中葫芦巴碱、马尿酸盐和甲酸盐水平的变化与COPD相关，而血浆代谢物谱未显示显著性的差异。Bertini等[11]采用NMR技术检测了COPD病人和健康志愿者的呼吸冷凝液和唾液，结果发现在去除唾液的影响后，病人组丙酮、丙氨酸和赖氨酸水平显著降低，而乳酸、丝氨酸、酪氨酸等代谢物水平明显升高。各个模型的诊断效力不一，须在更大量样品中去验证，但现有研究成果显示基于NMR的代谢组学技术具有在疾病快速诊断与鉴别诊断中的潜在应用价值。Paige等[12]通过检测不吸烟的正常人、吸烟的非肺气肿和吸烟的肺气肿患者的血浆小分子代谢物，从检测到的几百种代谢物中筛选出了12种差异性代谢物，并从中选取7种代谢物建立模型，模型的预测效率近80%。Ubbi等[13]采用LC-MS技术获取了COPD病人、胰腺癌病人和正常人血浆中氨基酸类等多种代谢物的信息，找到了COPD患者区别于正常人的潜在差异代谢物，发现COPD患者血浆中极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、二甲胺的水平有所下降，而苯丙氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和酮体类代谢物水平显著下降。上述研究也表明代谢组学能够较好地体现出COPD病人较为特殊的氨基酸等各类型代谢体系，具有潜在的应用于早期临床诊断的价值。

2.3 囊性纤维化

囊性纤维化严重损害肺功能，随着肺部疾病及肺功能损害的加重，进一步导致右心肥大、心力衰竭等更严重的并发症。Montuschi等[14]采用基于NMR的代谢组学方法，研究了稳定型、不稳定型囊性纤维化病人和健康人的呼出气冷凝液和唾液。结果显示冷凝液谱图和唾液谱图差异性很大，可排除唾液对呼出气冷凝液的污染，与健康对照组相比，稳定型囊性纤维化病人组冷凝液中乙酸和乙醇含量较低，异丙醇和丙酮等小分子代谢物含量较高；与不稳定型病人组相比，乙醇和异丙醇的含量相对较高，甲醇和乙酸含量相对较低。另一项研究中，Yang等[15]收集病人和健康人的痰液，并对痰液提取后采用LC-MS进行检测，发现痰液含有包括前列腺素、血栓素、白三烯等大量促炎性和抗炎性氧脂素，同时白三烯类与呼气容量呈负相关，亚油酸、血栓素等与呼气容量呈正相关。Joseloff等[16]对囊性纤维化病人和非囊性纤维化病人的血浆进行研究，从中找出92种有显著性差异的小分子代谢物，包括较低水平的3-羟基丁酸、中链肉碱、谷胱甘肽和较高水平的二羧酸类物质。细胞能量代谢的紊乱也反映了线粒体功能和胆汁酸代谢的紊乱，同时细菌代谢产物也发生了相应的变化，表明肠道菌群也出现了失调的情况。从上述研究中可以看出，人们正在积极运用代谢组学等新手段来寻找囊性纤维化的潜在生物标志物。

2.4 肺结核

现阶段结核病已成为严重威胁人类生存的三大疾病杀手之一。肺结核是最常见的结核病，有关结核病的代谢组学研究也日渐受到研究者的关注，并取得了一些研究成果。如Shin等[17]建立了结核杆菌感染大鼠模型和健康对照模型，用NMR代谢组学方法对模型组织和血浆样本进行检测，结果发现大鼠结核感染模型糖酵解、氨基酸代谢、磷脂代谢等均发生明显异常。Bagganahalli等[18]基于NMR和多元统计分析技术对结核杆菌感染的猪模型进行研究，发现谷胱甘肽等一批差异性代谢物，同时也证明基于NMR的代谢组学方法能够预测结核病的发展过程，具有作为未来快速诊断技术的潜力。Feng等[19]通过UPLC-MS的代谢组学技术对结核病人和健康人的血浆进行检测，观察到疾病组血浆中溶血磷脂酰胆碱、谷氨酸等代谢产物含量发生显著性变化，并能很好地将疾病组和对照组区分开。Weiner等[20]通过研究健康人、已感染但未发病的人和已发病人的血清的代谢组学，从代谢物谱图上观察到氨基酸类、核酸类和脂质类代谢通路发生了变化，结核病人组吲哚胺2，3-双加氧酶1活性显著升高。该研究也为结核病生物标志物的开发探索了一条新的方向。Che[21]等采用GC-MS的代谢组学方法研究了结核病人和健康志愿者的血清，结果显示结核病人血清中5-氧脯氨酸均处于较低水平，并进一步在大量结核病人中进行了验证，表明5-氧脯氨酸可能是一个肺结核和肺病理损伤的生物标志物。Chen等[22]基于NMR技术来研究不同菌株对牛的感染能力，发现牛结核杆菌和人结核杆菌对牛都有感染能力，并且感染后的牛有将结核杆菌传染给人的能力，NMR技术能区分出不同菌株感染的牛。Zhou等[23]用基于NMR的代谢组学技术和OPLS-DA模型，分析来自肺结核病患者和健康志愿者的血样，筛选出了乙酰乙酸、丙酮等17种潜在生物标志物，进一步证明代谢组学技术可以作为临床诊断肺结核病的潜在技术手段，并为阐明结核病的发病机制提供技术支持。

2.5 肺癌

肺癌患者中男性占据很大比重，且年龄多数在40岁以上。吸烟和肺癌的关系已在多个国家进行过调查，结果均表明吸烟与肺癌有着较为密切的关系。此外，其他因素如空气污染、职业性致癌因素和遗传因素等也都可能导致肺癌的发生。我国肺癌发病率和死亡率都呈现上升趋势，已成为影响居民健康的主要恶性肿瘤之一。

Rocha等[24]采用NMR的代谢组学技术对肺癌患者和健康志愿者的血浆进行研究，发现肺癌组血浆中高密度脂蛋白水平较低，极低密度脂蛋白水平较高，丙酮酸和乳酸的含量升高，而柠檬酸、葡萄糖及多种氨基酸类代谢物含量降低。研究还发现，上述变化在疾病初始阶段即有，可能与癌症生化进程相关，这对于研究其相关的代谢通路有重要意义。Ho⁃ri等[25]对健康人和肺癌患者的血清样本进行了代谢组学研究，结果显示23种内源性代谢物发生了显著性变化，不同阶段的肺癌患者体内代谢物表现出特征性的变化。另外，对肺癌患者的肿瘤组织和癌旁组织进行了分析，结果发现其中多种代谢物发生了显著性变化。Carrola等[26]采用1H-NMR的代谢组学技术对肺癌患者和健康志愿者的尿液进行了研究，结果发现肺癌患者尿液中马尿酸盐和葫芦巴碱含量降低，而谷氨酰胺等代谢物相对对照组水平升高。Fan[27]等利用13C同位素标记代谢组学方法对非小细胞肺癌患者癌组织和癌旁正常组织进行了研究，结果显示肿瘤组织与癌旁正常组织相比，丙氨酸、乳酸等代谢物水平有显著性变化，提示癌组织中糖酵解和三羧酸循环代谢活跃。牛艳杰等[28]采用GC-MS的代谢组学方法对19例肺癌患者和15例其他肺部疾病患者的血清及尿液样本进行分析，并采用正交偏最小二乘判别分析法建立模型，经过多变量统计分析和t检验找出潜在的差异性代谢产物。结果显示两组有较明显的分离趋势，找到乳酸、丙酮酸、柠檬酸等13种血清相关差异代谢物，肌酐、核苷酸等7种尿液相关差异代谢物，为在分子水平辅助诊断肺癌提供了参考。Duarte[29]等采用1H-NMR代谢组学方法对22例COPD患者和77例不同阶段的肺癌患者的血浆进行研究，经多元统计分析并建立OPLSDA模型，该模型能够非常明显地将COPD患者组和各期肺癌患者组分离开来，相对于COPD患者，肺癌组乳酸、柠檬酸、甲醇等代谢物水平下降，亮氨酸、赖氨酸、脂类等水平升高，同时还发现异亮氨酸、肌酐和甘油等可能与肺癌疾病进程相关。Li等[30]使用超高液相质谱技术对收集到的肺癌患者和健康志愿者的血浆进行了代谢组学研究，通过多元统计分析建立模型，结果显示两组有明显的分离趋势，检测出的差异代谢物大部分与脂代谢相关。上述研究证明了代谢组学技术在肺癌等疾病研究中有着巨大应用价值，为肺癌诊断方法的建立提供了一个新的研究方向，同时也可以为其相关代谢机制的研究提供一些技术上的支持。

3 结语

上述研究结果显示代谢组学技术能够将这些呼吸系统疾病患者组和对照组区分开，并找到了一些潜在的生物标志物，但是目前还没有真正的生物标志物应用到现实诊断当中。因为潜在的生物标志物到真正的生物标志物及其相关的代谢通路和调节机制的阐明依然有很长的一段距离。当然这不仅需要科研工作者的努力，还需要临床医生、病人及其家属的积极配合。代谢组学技术经过十多年的发展虽然已经有了较为明显的进步，但还有很多工作要完善，同时我们还应将作为系统生物学的重要组成部分的各种组学技术综合利用起来，这样代谢组学技术将能在疾病的诊断及疾病发生发展机制的阐明中发挥更大的作用。

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