大蒜芥Δ′－吡咯啉－5－羧酸合成酶 基因（P5 CS）的克隆及表达分析

刘静静，曲延英，姚正培，朱燕飞，高文伟，陈全家

（新疆农业大学农业生物技术重点实验室，新疆 乌鲁木齐830052）

干旱等非生物逆境胁迫影响着部分植物及农作物的生长发育，当遭遇干旱等逆境胁迫时，植物一系列复杂的与抗逆相关的特定基因被诱导表达，植物体内脯氨酸的累积合成量相应增加［1］。有关研究表明，脯氨酸的累积变化与植物耐受逆境胁迫强度呈正相关，其生理代谢具有复杂的调控机制［2］。在逆境胁迫条件下，植物体内脯氨酸合成的增加或者脯氨酸降解的减少都会影响脯氨酸的积累［3－5］。脯氨酸含量的增加与植物的抗逆性密切相关，可能会影响相关蛋白质的稳定性［6－7］。研究表明，脯氨酸在细胞保护和调节渗透平衡方面起着重要作用［8］，渗透压的提高使细胞膜系统结构完整而保持膜蛋白不变性，脯氨酸的积累能稳定蛋白质的结构和活性［9］。目前已从拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Or yza sativa）、大豆（Glycine max）、甘蔗（Sugarcane officinarum）、普通菜豆（Phaseoleae vul garis）、苜蓿（Medicago sativa）、朝鲜碱茅（Puccinellia china mpoensis）等植物中克隆出了P5CS 基因［10－15］。

大蒜芥（Sisybriu m altissi mu m）为十字花科类草本植物，是分布于我国新疆北部荒漠及其毗邻草原带的短命植物，是新疆北部地区沙漠稳定沙面的主要贡献者和沙漠受干扰破坏后植被恢复的先锋植物［16］，是逃避干旱的一类特殊生态型植物［17］，也属于避逆等类型的生物［18］，具有一定的防风固沙和保持水土的作用，对改善土壤环境有重要意义。本研究对大蒜芥Sa P5CS1 耐旱基因的克隆及生物信息学进行分析，有助于揭示大蒜芥Sa P5CS1 基因在逆境胁迫下的表达以及生长发育中所起到的调控作用，为进一步研究和挖掘利用基因工程技术培育优良抗旱作物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试剂

大蒜芥种子用75%乙醇消毒，无菌水清洗6～8次，春化处理2 d，点播至灭过菌的培养基质中（营养土∶珍珠岩∶蛭石∶砂砾＝3∶1∶1∶1），每穴4株，每盘50穴，于25 ℃／16 ℃（昼／夜）温室中生长28 d后，待其长出五叶一心时，取25% PEG－8000分别胁迫处理3、6、12、24 h的叶和根为材料，未胁迫处理（0 h）作为对照材料。

Ta Ka Ra LA Taq、Ta Ka Ra－RACE、Ta Ka Ra Pri meScript RT reagent Kit、SYBR Green II荧光定量试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；TRIzol、DNA Marker、Taq DNA 聚合酶、p MD®18－T载体、凝胶DNA 回收试剂盒、DH5α感受态细胞购自天根生化科技有限公司；PEG 8000 购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 引物设计

根据同源克隆的方法获得了大蒜芥的P5CS基因序列核心片段，参照Ta Ka Ra试剂盒说明，通过Pri mer Premier 5.0 设 计Sa P5CS1 的5′和3′RACE套式PCR 引物序列、全长PCR 引物序列由北京华大基因公司合成（表1）。

表1 大蒜芥Sa P5CS1 所用的引物名称和序列Table 1 The used pri mer and sequences of Sa P5CS1 gene of Sisybrium altissi mum

1.3 总RNA 的提取

参照天根生化科技有限公司的TRIzol试剂盒提取总RNA，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 质量的完整性。

1.4 Sa P5CS1 基因的克隆

以大蒜芥总RNA 为模板，参照Ta Ka Ra宝生物工程（大连）有限公司的D315和D314试剂盒合成5′RACE和3′RACE的首链c DNA 及套式PCR反应。反应程序：94 ℃3 min，94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃2 min，进行25个循环，最后72 ℃10 min，反应于4 ℃终止。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，纯化回收并连接到p MD®18－T 载体上，转化DH5α感受态细胞，菌液PCR 鉴定阳性克隆，送上海生工测序。获得Sa P5CS1 基因全长c DNA 序列。

1.5 Sa P5CS1 基因生物信息学分析

使用NCBI上的ORF Finder（http：／／www.ncbi.nl m.nih.gov／gorf／orfig.cgi）获 得 大 蒜 芥Sa P5CS1 基因序列完整的开放阅读框，并通过Blastn（http：／／blast.ncbi.nl m.nih.gov／Blast.cgi）程序对大蒜芥Sa P5CS1 基因的c DNA 序列进行相似性搜索，Blastp（http：／／blast.ncbi.nl m.nih.gov／Blast.cgi）在线程序对Sa P5CS1 编码蛋白进行相似性搜索。使用COILS（http：／／www.ch.e mbnet.org／soft ware／COILS＿f or m.ht ml）在线分析编码蛋白 的 卷 曲 螺 旋 结 构。使 用PSIPRED（http：／／bioinf.cs.ucl.ac.uk／psipred／）预测蛋白的二级结构。使 用SWISS－Model（htt p：／／s wiss model.expasy.or g／）在线自动模式预测蛋白的三级结构。使用Ex PASy 的PROSITE（http：／／prosite.expasy.org／）对其蛋白的功能结构域进行预测，Sa P5CS1基因与其他已经克隆出的P5CS 基因的进化树通过DNA MAN 软件生成，并分析其进化关系。

1.6 Sa P5CS1 基因的表达分析

参照天根生化科技有限公司的TRIzol试剂盒提取样品总RNA。参照Ta Ka Ra Pri meScript RT reagent Kit试剂盒说明进行SYBR®Green反转录，荧光定量q－PCR 引物：Sa P5－q F1，5′－ACTTGGTGCTGAGGTGGG－3′；Sa P5－q R1 5′－TTGGATGGGAATGTCTTG－3′；A－F，5′－TGACGGAGAATT－AGGGTTCGA－3′；A－R，5′－CCGTGTCAGGATTGGGTAATTT－3′作 为 内 参 引 物，采 用Real－Ti me PCR 两步法扩增程序：第1步95℃30 s，第2步95℃3 s，60 ℃30 s，40个循环。溶解曲线程序：95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。利用2－ΔΔCt值分析待测基因在不同组织器官的表达差异，其结果由柱状图表示。计算公式：

ΔCt0＝Ct（0）－Ct（A0）；

ΔCts＝Ct（S）－Ct（AS）；

ΔΔCt＝ΔCts－ΔCt0；

2－ΔΔCt＝2－（ΔCts－ΔCt0）

式中，Ct（0）为对照组目的基因；Ct（A0）为对照组内参基因；Ct（S）为待测目的基因；Ct（AS）为待测内参基因；2－ΔΔCt为目的基因的量。

2 结果与分析

2.1 大蒜芥总RNA 的提取

按照天根生化科技有限公司的TRIzol试剂盒提取说明书提取经25% PEG－8000胁迫处理的大蒜芥总RNA，紫外分光光度检测OD260／OD280值为1.99，表明RNA 没有蛋白质污染，1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测显示28S、18S和5Sr RNA 的条带清晰，并且28S r RNA 的亮度约是18S r RNA 的两倍（图1 A），表明RNA 质量完整性较好。

2.2 Sa P5CS1 基因的克隆

根据大蒜芥P5CS 基因片段序列，分别设计5′RACE和3′RACE 特异性引物，获得了长度大约1 000 bp（图1B）和700 bp的条带（图1C），测序结果通过DNA MAN 拼接获得全长c DNA 序列，BLAST 比对结果与其他植物的P5CS 基因有较高的同源性，因此该基因命名为Sa P5CS1。根据已克隆的Sa P5CS1 的c DNA 全长拼接序列设计全长特异性引物，PCR 扩增获得1 900 bp左右的条带（图1D），与预测基因的大小基本一致。

2.3 Sa P5CS1 基因生物信息学分析

图1 大蒜芥叶片总RNA提取及SaP5CS1 基因的克隆Fig.1 Electrophoresis analysis of total RNA of Sisybrium altissi mum leaf and Sa P5CS1 gene cloning

从核酸和蛋白质两个方面来分析Sa P5CS1 基因序列的理化特征、结构、功能及系统发育等生物信息，预测大蒜芥Sa P5CS1 基因的相关性质功能。通过序列比对，Sa P5CS1 基因全长1 907 bp，包含一个长度为1 719 bp的开放阅读框，5′非翻译区为140 bp，3′非翻译区为48 bp，推测其编码含5 732个氨基酸。编码蛋白质的等电点（pI）为4.95，分子量为156.279 k Da。使用NCBI上的Blast p在线分析Sa P5CS1 基因的结合位点和结构域，结果显示，Sa P5CS1 基因的N 端是氨基酸激酶（AAK）超基因家族成员含有，谷氨酸激酶（G5 K）保守结构域，C 端是醛脱氢酶（ALDH－SF）超基因家族成员，包含有谷氨酸磷酸还原酶（GPR）保守结构域（图2）。COILS在线程序预测该蛋白的卷曲螺旋结构，结果显示，在186－199位点存在跨膜结构。PSIPRED 在线预测蛋白质的二级结构，包含12个β－折叠和18个α－螺旋，这与其他植物P5CS 蛋白的二级结构组成类似。预示该蛋白具有与其他物种P5CS 蛋白相同的转录激活功能。

将Sa P5CS1 基因进行Blastp比对分析，发现与甘蓝型油菜（Brassica napus，AAK01360.1）、基隆南芥（Arabis stelleri，ADG08111.1）、拟南芥（AAL87255.1）、琴叶拟南芥（Ar abidopsis l yr ata，XP002881679.1）、大豆（NP001238153.1）、小麦（Triticum aestiu m，BAD97364.1）、水稻（AAS89034.1）、马铃薯（Sol anu m tuberosu m，XP006346827.1）、玉米（Zea mays，ACR33941.1）、亚洲棉（Gossy pium arboreu m，ACI62865.1）和野生茄子（Sol anu m tor vu m，AEN04068.1）的蛋白序列相似性分别为98%、96%、96%、95%、77%、74%、75%、77%、74%、80%和78%。由多序列比对发现，Sa P5CS1 氨基酸序列中具有4 个保守域（图3），Ⅰ，亮氨酸保守域：DNDSLAALLALELKADLLILLSDVEGLY；Ⅱ，谷氨 酸 激 酶 保 守 域： SRVGRGGMTAKVKAAVNAAYAGIPVIITSGYAAENI.KVLRG.R；Ⅲ，NADPH 结 合 保 守 域：SGNGLLLKGGKEA.RSNAIL HKVITDAIP.TVGGKLIGL；Ⅳ，谷氨酸半醛脱氢酶保守域：RHNASTKFSDGFRFGLGAEVGLSTGRI HARGPVGV。Sa P5CS1 氨基酸的4个功能域与其他物种的差异较小，都相对比较保守。ATP结合位点的差异，需进一步分析研究。

图2 Sa P5CS1 编码蛋白Blastp分析结果Fig.2 Analysis result of Sa P5CS1encoding protein by blastp

图3 SaP5CS1氨基酸序列和其他植物P5CS氨基酸比较分析Fig.3 Comparison of the deduced amino acid sequences of SaP5CS1 with other plants

采用DNA MAN 分析Sa P5CS1 基因的氨基酸序列与其他物种P5CS 基因氨基酸序列的进化关系（图4），发现与甘蓝型油菜、拟南芥、基隆南芥和琴叶拟南芥的P5CS 关系较近，而与大豆、亚洲棉、小麦、水稻、马铃薯和野生茄子的关系较远，使用SWISS－Model在线程序的自动模式对该蛋白的三级结构进行预测分析，得到该蛋白的三级结构图（图5）。

2.4 Sa P5CS1 基因的表达分析

本试验采用实时荧光定量PCR 的方法分析大蒜芥Sa P5CS1 基因在PEG 胁迫下表达的情况。Sa P5CS1 在PEG 模拟胁迫下叶的上调表达相对不太明显，但根在PEG 胁迫12 h时的表达量是无胁迫时的31.4 倍，由于胁迫临界浓度为25%PEG－8000，12 h后叶片开始逐渐萎蔫，24 h时萎蔫程度较严重，出现枯死植株的现象（图6）。

图4 Sa P5CS1 和其他植物P5CS 基因进化树Fig.4 Phylogenetic tree of Sa P5CS1 and other P5CS genes

图5 SaP5CS1蛋白的三级结构同源建模Fig.5 The tertiary structure of SaP5CS1 protein

3 讨论

干旱、盐碱和低温等渗透胁迫因素是导致植物生长发育缓慢的主要非生物胁迫因素。在渗透胁迫下，植物的渗透调节和代谢调控不断发生变化，为适应胁迫，主要通过增加渗透调节物的合成来抵御干旱、盐碱、低温等逆境胁迫。脯氨酸是植物体内分布较为广泛的渗透调节物质之一，Δ′－吡咯－5－羧酸合成酶是植物体内合成脯氨酸的关键酶。相关研究表明，植物越来越多的有关编码脯氨酸合成和降解相关酶的基因已经被克隆和研究，其调节相关酶的作用因子尚未阐明［19］。近年来，许多研究者试图通过转基因工程来提高植物自身体内脯氨酸的含量，从而获得对于逆境胁迫抗性较强的转基因植株。

图6 大蒜芥根和叶的Sa P5CS1在PEG 胁迫下不同时间的表达Fig.6 The expression of SaP5CS1 of leaf and root of Sisybrium altissi mum in different times under PEG stress

本研究采用大蒜芥作为抗旱材料，并从中克隆了Sa P5CS1 基因，多序列比对发现Sa P5CS1 基因氨基酸序列与其他物种的P5CS 基因具有很高的同源性和相似的保守域。卷曲螺旋结构检测结果显示Sa P5CS1 基因中存在跨膜结构。根据氨基酸多序列比对结果推测Sa P5CS1 基因分别属于氨基酸激酶（AKK）和醛脱氢酶（ALDH－SF）超基因家族中的一个成员。Sa P5CS1 基因的系统进化树分析结果说明，其与甘蓝型油菜和拟南芥的P5CS 基因有较高的同源性，可能与他们具有相似的抗逆功能有关。实时荧光定量PCR 相对表达分析显示，大蒜芥Sa P5CS1 基因在干旱胁迫条件下脯氨酸积累含量相对增加，与陈吉宝等［20］研究中提到Pv P5CS1 基因在转基因植株体内正常表达，而在盐和干旱胁迫下转基因幼苗脯氨酸含量显著增加，从而改善了植株的抗旱耐盐能力的结果相符，由此推断大蒜芥Sa P5CS1 基因与短命植物的抗旱性相关。其逆境胁迫下的抗逆相关功能需进一步验证。Sa P5CS1基因的克隆也为进一步研究分析其耐旱分子机制和抗逆分子育种打下基础。

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