一氧化氮对动物胚胎附植影响的研究

魏　东， 孙全文

（河北北方学院实验动物中心， 张家口　075000）

一氧化氮对动物胚胎附植影响的研究

魏东， 孙全文

（河北北方学院实验动物中心， 张家口075000）

一氧化氮（NO）作为一种特殊的生物传递信号分子，日益受到生命科学各领域的普遍重视。机体内的NO由一氧化氮合酶催化合成，是动物体内发挥多种生物学效应的自由基，是一种重要的生物信使，它几乎对哺乳动物的所有系统都会产生一定的作用。近几年的研究结果表明，NO对动物胚胎附植发挥着重要作用。

一氧化氮（NO）； 胚胎附植； 一氧化氮合酶

一氧化氮（NO）是人们熟知的大气污染物之一。近年来， 国内外的研究者做了很多关于NO对动物生理功能影响的研究， 发现内皮源性舒张因子（endothelium-derived relaxing factor， EDRF）的化学本质为NO，以其广泛而重要的生物学作用成为研究热点； 同时，作为一种自由基性质的生物活性分子， NO也是目前在动物体内发现的最小、最轻、最简单、有重要生理功能的生物信息分子， 几乎存在于所有类型的组织细胞中， 是调节血管功能和炎症反应、介导组织重建和细胞凋亡、影响胚胎发育和附植等多种生理过程的重要旁分泌调节因子［1，2］。

附植是整个妊娠最重要的一个环节，是哺乳动物囊胚滋养层细胞与母体子宫上皮细胞之间逐步建立组织生理上联系的过程，成功附植有赖于胚泡与母体相互识别、胚泡发育与母体子宫变化的同步以及抑制母体的免疫排斥反应和母体接受性等一系列反应［3］。近年来，学者们对NO在胚胎早期发育及附植过程中可能产生的生理调节作用做了大量的研究，并获得重大进展。

1　NO的生化性质

NO分子量仅30 000，是一种重要的生理功能信使分子， 结构简单， 性质不稳定， 易运动， 生物半衰

NO是一种不带电荷，含一个未配对电子的自由基，性质活泼，参与体内多种反应，是生物系统中不可缺少的基本分子之一。NO在体内由一氧化氮合酶（NO synthase，NOS）催化合成。NOS以L-精氨酸和分子氧为底物，催化L-精氨酸的两个等价胍氮之一，经5电子氧化反应生成NO和L-瓜氨酸。NO以旁分泌方式（paracrine）作用于相邻组织。因此NO的局部含量主要取决于该组织中NOS的活性、数量和亚型，而目前通常按组织来源和表达方式将NOS分为神经元型NOS（neuronal NOS nNOS）、内皮型NOS（endothelial NOS，eNOS）诱导型NOS（indueible NOS，iNOS）和结构型NOS （constitutive NOS，cNOS）［5］。

NO具有亲脂性，可透过细胞膜扩散到临近的靶细胞中，并作用于细胞中的水溶性鸟苷酸环化酶，与该酶亚铁血红素分子中的铁离子结合，激活该酶，使环磷酸鸟苷（cGMP）的产量增多。而cGMP是体内中重要的第二信使之一，它可产生一系列生理反应。NO的效应途径是多种多样的，除广泛存在的NO/cGMP系统外，还存在NO/COX、NO/PKC、NO/IRP等调节系统。

NO在各种雌性动物的繁殖过程中发挥着重要的调节剂作用， 如妊娠的维持、分娩、胎盘的生长发育、调节基本促性腺激素释放激素（gonadotropinreleasing hormone， GnRH）的产生、刺激促黄体生成素（luteotropic hormone，LH）的分泌、卵泡的发育及妊娠期间血液流量［6］，其参与多种细胞信号传递路径［7］。实验证明，环磷酸腺苷（cAMP）/cGMP的比例变化对胚胎的生长发育和分化具有重要的调节作用［8］。NO刺激鸟苷酸环化酶，促使cGMP生成，是cAMP/cGMP比例的主要调节者，是胚胎正常发育所必需。同时，血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子都依赖NO生成量的多少来调节子宫和胎盘的血流， NO通过扩张脐动脉血管而使胎儿胎盘血流量增加，加速氧和营养物质的输送，以利于胎儿的生长，NO是胎盘血流、氧和营养物质交换的关键因子。研究表明在绵羊妊娠的30 d到60 d间，胎盘NO的合成显著增加； 从妊娠l00 d开始增加绵羊胎盘NO的合成，可显著增加胎盘胎儿血流，加快胎儿的增长［9］。因此，NO代谢水平可以作为监测胚胎发育是否正常的一项重要指标。

2　NO对胚胎附植的促进作用

胚泡附植是一个母体和胚胎都主动参与的生理过程，其发生既决定于胚泡的主动性，也决定于子宫内膜是否做好准备，两者的同步化，才能使胚泡的附植顺利进行，而胚胎发育不良和子宫环境不适宜都会导致附植失败。NO正是从调节胚胎发育和子宫环境两方面参与附植过程。首先，NO是胚胎分裂分化的调节因子。Gouge等［10］检测了小鼠附植前胚胎产生NO的能力，首次证明了NO在调节胚胎附植方面的重要性和对于正常胚胎发育的必要性。Sanyal等［11］的实验表明，当将一定浓度的NO供体硝普钠（sodium nitroptusside，SNP）加入到培养基时能显著增加绒毛膜癌JEG-3细胞的增殖并抑制滋养层细胞的分化，证明了nNOS在人滋养层细胞的存在和NO在囊胚细胞增殖和分化中的作用。基质金属蛋白酶-2 （MMP2）是一种启动附植和胎盘形成的必需成分。Novaro等［12］的实验表明，iNOS在接近子宫上皮MMP2表达增多的位点即在附植前囊胚的表面被表达。NO供体增加MMP2在培养的子宫组织碎片中的活性，而NOS抑制剂使MMP2活性下降，结果证明囊胚产生的NO有助于子宫MMP2的产生。

廖海艳等［13，14］在小鼠胚胎附植期通过子宫角注射NOS的非特异性抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）和L-NAME+SNP方法研究了NO对小鼠胚胎植入的影响，结果表明，与对照侧相比，L-NAME处理组植入胚胎数降低，在L-NAME中加入NO供体SNP时，则不影响胚胎植入数； NO作为一种内源性平滑肌松驰剂和血管扩张剂，可以通过局部调节子宫内膜金属蛋白酶（MMP-9）的表达而参与胚胎植入过程的调节，对MMP-9 mRNA的表达有着极为显著的调节作用，并进一步影响子宫内膜发育和胚胎的附植。

在哺乳动物早期胚胎发育过程中，附植前和附植过程中都能检测到与NO相关的酶类。Novaro等［15］观察到Ca2+依赖型NOS （eNOS）的活性在胚胎附植的前几天逐渐增加， 非Ca2+依赖型NOS （iNOS）的活性仅在附植开始时增加，接着两者的活性均下降，表明NO在附植过程中发挥重要作用，NO的产生对于胚胎附植成功是必要的。

为了进一步阐明NO促进胚胎附植的机制，Zhang等［16］通过明胶酶谱法及RT-PCR发现经NOS抑制剂L-NAME处理后，小鼠胚胎围植入期子宫基质金属蛋白酶-9（MMP9）、血管内皮生长因子（VEGF）及其受体mRNA的表达有不同程度的下降；当L-NAME与供体SNP同时注射小鼠时，MMP9、VEGF及其受体mRNA的表达都恢复到正常水平。结果表明，N O在小鼠胚胎植入中可通过调节MMP9、VEGF及其受体的表达参与血管新生，从而对胚胎植入起到调节作用。同时也表明，阻止NO的产生，附植就不能正常发生。

在胚胎发育和附植过程中，胚胎中多种亚型的NOS共同起作用，而eNOS可能在此过程中发挥主要作用。据报道［17］，单个NOS基因敲除的小鼠植入前胚胎发育无异常， 而双基因（eNOS/iNOS，eNOS/nNOS，iNOS/nNOS）敲除的小鼠胚胎在发育过程中最先损失。这说明虽然鼠胚胎多种亚型的NOS可以起代偿作用，但胚胎自身产生NO对于早期鼠胚发育是必需的。NO调节胚胎发育的精确机制还不明了。Chen等［18］观察到至少两种NOS（eNOS和iNOS）在正常小鼠早期胚胎有表达，其在囊胚期免疫染色强于2-、4-细胞期和桑椹胚。NO/ cGMP信号传导通路在植入前胚胎发育中尤其重要，而L-NAME能抑制早期囊胚发育。Tranguch等［17］证实植入前各期鼠胚胎均有eNOS表达。NO缺乏或cGMP过多能抑制胚胎发育但不引起DNA损伤， 说明NO至少部分通过cGMP途径调节胚胎发育［19］。这些研究表明， NO及其各亚型（主要是eNOS）在胚胎附植过程中可能起着重要的调节作用。

另外，附植是否成功，子宫的环境也发挥重要作用，子宫血管通透性的增强是附植的一个标志，子宫充足的血液供给对于胚胎附植是十分必要的。在血管中，NO由eNOS催化合成，是有效的血管扩张和血小板抑制因子。附植前子宫NOS活性明显增加，附植发生时附植点子宫组织中eNOS和iNOS含量也显著上升，说明NO参与子宫微环境的建造［20］。孕酮（progesterone，P4）和雌二醇（estrogen，E2）诱导子宫支持妊娠，使附植处发生剧烈的组织重塑（tissue remodeling），而NO作为P4和E2的下游效应分子［21］，在重塑中也参与了血流量、毛细血管通透性及免疫抑制状态的调节。

3　NO对胚胎附植的抑制作用

适量浓度的NO是正常胚胎发育所必需的，但当其失衡时则会导致胚胎发育阻滞或凋亡。研究表明［22，23］，高浓度的NO对早期胚胎的发育有害。Barroso等［24］研究显示， DETA/NO注入小鼠体内， 会导致小鼠胚胎附植以剂量依赖的方式抑制，在每日注入20 mmol/L剂量DETA/NO的小鼠没有观察到附植位点， 而对照组小鼠有81.8%的附植率， 结果表明，高浓度的NO既能抑制小鼠胚胎的体外发育又可抑制胚胎的体内附植。Athanassakis等［25］使用IFN-γ、TNF-α、LPS、5-AzaC和DF4胚胎毒性因子诱导早期胚胎产生了NO，这与iNOS或eNOS的诱导有关。研究还证实，在流产妇女某些系统的血清中发现了NO的胚胎毒特性，这种胚胎毒性导致NO在早期胚胎死亡中起潜在作用，而NO过量产生也表明其是脂多糖诱导的胎儿排斥机制的一部分。

此外，NO与免疫调节的关系也很密切。受抗原、细菌脂多糖（LPS）及细胞因子的刺激，机体的多种免疫细胞表达iNOS。Ogando等［26］研究表明，在LPS诱导的早期胚胎吸收模型中，小鼠胚胎植入位点表达iNOS，蜕膜巨噬细胞也表达iNOS口服或注射NOS的抑制剂氨基胍（AG），可以降低LPS诱导的早期胚胎吸收。由此可推测，子宫局部高浓度的NO可能作为一种效应分子介导早期胚胎吸收过程。由iNOS催化底物生成的高浓度NO具有细胞毒性作用，能够损伤胚胎，支持胚胎被吸收。这些研究结果表明NO在调节胚胎发育中起“双刃剑”作用。

4　结语

虽然NO不是调节胚胎附植过程的唯一介导者（还有许多NO之外的机制参与），但作为一种重要的信使分子，NO从胚胎发育和影响子宫环境两方面参与胚胎附植，NO的浓度对不同阶段的胚胎发育状态有不同影响，用适当的方式增加NO/NOS对调节发育有重要的影响，这将为调控动物繁殖技术的深入研究提供良好的理论基础。

目前， 虽然对NO的许多作用机制， 特别是其对生殖活动的影响还不是很清楚，但随着对动物模型NO/NOS的深入研究， 必将加深人们对其性质、生理功能、作用机理的认识， 对于了解NO对胚胎附植过程的作用分子机理有极其重要的意义，同时也可以为提高胚胎附植率、动物产仔数及NO相关疾病的治疗提供重要的理论依据， 从而有助于动物医学和人类临床医学领域进一步阐明机体某些生理功能调节及某些疾病的发生机制以及许多疑难病变的治疗提供新的思路。另外， 在新药开发、提高动物繁殖性能等方面， NO也将会展示出广阔的应用前景

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Effects of Nitric Oxide on Embryonic Implantation in Animals

WEI Dong， SUN Quan-wen
（Laboratory Animal Center， Hebei North University， Zhangjiakou075000， China）

Nitric oxide （NO） is a special biological signal molecule，it is being paid attention to the life sciences in various fields. The NO of the organism is synthesized by catalysis of nitric oxide synthase （NOS）. NO is a free radicals in body playing a variety of biological effects， and an important biological messenger producing certain effects in almost all systems of mammals. The recent researches show that NO plays an important role on animal embryo implantation.

Nitric oxide； Embryonic implantation；Nitric oxide synthase

Q95-33

A

1674-5817（2015）04-0341-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.021

2015-05-31

魏东（1971-）， 男， 博士， 副研究员， 研究方向: 基础兽医学。E-mail: hbzjkwd@163.com期短（约为3s～5s），溶解度随水溶液的离子强度增加而降低，在正常体温与动物组织细胞内外液离子强度的条件下，NO溶解度约为1.55 mmol/L［3］，NO以溶解于水的状态存在于组织细胞内外液中。NO具有疏水性，而生物膜有疏水性结构，NO在生物膜中的溶解度比在水中高6～7倍。NO不带电荷可以自由通过生物膜。有的学者认为［4］生物膜可当作细胞内外液中的NO贮存部位，但是在病理、生理情况下生物膜中的NO较在细胞内外液更能显示毒性作用。