美洲旱獭感染实验饲养管理及实验技术探讨

2015-10-14薛康宁李晓燕李利利张贺源卢选成

实验动物与比较医学 2015年4期

关键词：旱獭美洲病毒

薛康宁，李晓燕，李利利，张贺源，卢选成

（1. 中国疾病预防控制中心实验动物中心，北京 102206；2.中国疾病预防控制中心病毒病所，北京　102206）

美洲旱獭感染实验饲养管理及实验技术探讨

薛康宁1，李晓燕1，李利利2，张贺源1，卢选成1

（1. 中国疾病预防控制中心实验动物中心，北京 102206；2.中国疾病预防控制中心病毒病所，北京102206）

现代生命科学研究对实验动物的要求越来越广泛、严格、多样化［1］，从用标准化的实验动物做研究发展到利用特殊的实验用动物，从用已经人工驯化的动物发展到利用野生动物。美洲旱獭（Marmota monax，woodchuck）在感染“美洲旱獭肝炎病毒”（woodchuck hepatitis virus， WHV）后会出现一些与人感染肝炎病毒后非常相似的临床症状，包括亚临床症状或一过性感染、慢性感染症状、以及肝癌，因此美洲旱獭是评价针对肝炎病毒治疗性疫苗的理想模型［2］，而建立美洲旱獭饲养技术和实验技术并规范化，是开展所有研究工作的前提和基础，本文就美洲旱獭甲型肝炎病毒感染实验中涉及到的饲养管理及实验技术进行探讨，以期为相关研究提供参照。

1　美洲旱獭饲养管理

1.1美洲旱獭的生物学特性

美洲旱獭，俗称土拨鼠，属啮齿目（Rodentia）松鼠科（Sciuridae）旱獭属（Marnota），是松鼠科动物中体型最大的一种［3］。近年来应用旱獭制作人类疾病的动物模型研究越来越多［4，5］。深入了解旱獭的生物学特性，掌握旱獭的饲养管理和实验技术，是开展相关研究的重要保证。

1.1.1生物学特性及相应的饲养要求旱獭为穴居动物，洞穴是旱獭冬眠、繁殖、过夜、避敌、休息、玩耍的共用场所［3］。因此在旱獭的饲养过程中需要给旱獭提供一个干燥清洁，光照强度较弱的饲养环境。旱獭耐饥饿，不饮水，喜欢食入带有露水的草［3］，因此在旱獭的饲养过程中应提供适当的新鲜蔬菜，如圆白菜等，来为旱獭提供必需的水分及纤维素等营养。

1.1.2旱獭饲料要求旱獭为草食性动物，凡牛、羊、兔采食的饲料均可作为旱獭的饲料［3］。本实验室对美洲旱獭饲喂由北京市科奥协力饲料有限公司生产的兔生长繁殖饲料，主要营养成分: 粗蛋白18.93%，粗脂肪3.04%，粗纤维10.52%，水分7.98%。

1.2风险评估

生物风险评估是在ABSL-2实验室内安全开展实验的重要前提，是实验室采取风险控制措施、建立安全管理体系和制定安全操作规程的依据［6］。将风险评估的内容及时告知实验人员及工作人员可大大加强生物风险的防控力度，避免出现实验室感染事件。

本次感染实验的病原微生物为甲型肝炎病毒（HAV），按照加拿大公共卫生署官方网站提供的病原体安全资料表及风险评估（pathogen safety data sheets and risk assessment）中关于甲型肝炎病毒的内容对本次实验进行风险评估［7］:

1.2.1病原介绍特性: 甲型肝炎病毒属于小核糖核酸病毒科，肝病毒属，二十面体结构，无囊膜，已鉴定出7种基因型（I～VII）；致病性: HAV只会引起急性肝炎，与慢性肝炎病毒并无关系，大多数被感染者并不表现出特异性临床症状，伴有胃肠道症状，病程通常少于2个月，在极少数情况下，HAV能引起严重的症状，导致患者死亡。宿主范围: 人类，黑猩猩以及其他非人灵长类动物例如狨猴、绢毛猴、枭猴、松鼠猴也对HAV易感。感染剂量: 未知。传播途径: 通常为粪口传播，最常报道的HAV感染来源是家庭内，或与其他被感染人员的接触，其他潜在的感染途径包括性传播，在HAV流行国家旅行，以及非法使用受污染的药物与针头，罕见通过食入或饮入受感染的食物或饮水传播的情况，通过输血或使用血液制品进行传播的情况更加罕见。潜伏期: 平均为28～30 d（最短为15 d，最长为50 d）。传染性: 在潜伏期的后半段时间传染性最强，并且在出现黄疸后持续几天强的传染性。不会出现粪便长期排毒的情况。稳定性与存活力: 1%次氯酸钠可灭活甲肝病毒，85℃，1 min即可灭活，病毒离开宿主后在室温下或酸性条件下极其稳定，这样可以保证病毒在环境中存活，并且可以通过受污染的食物或饮水来传播。

1.2.2治疗药物及预防还未发现对甲肝的有效特异性治疗，建议卧床休息，均衡营养，避免饮酒及其他损肝毒物；暴露于HAV病毒的人员应在两周之内接受HAV免疫球蛋白注射（0.02 mL/kg体质量），对于实验室工作人员，在暴露之前注射灭活HAV疫苗可有效预防。

1.2.3实验室风险实验室的样本来源为被感染人员或非人灵长类动物的粪便，其他来源还包括血液，肝组织以及胆汁；主要危险来源为注射带有HAV病毒生物样本（粪便、血液）或者间接接触被污染环境的表面。

1.2.4防范措施实验中的个人防护应包括实验服，手套及护目镜，所有可能产生气溶胶、高浓度或大量病毒的操作都应在BS48内进行，严格限制使用利器。

1.2.5实验废品处置所有相关材料用化学消毒液或蒸汽高压锅进行消毒，或者进行焚烧。

1.3动物来源、动物接收及人员的防护

雄性美洲旱獭6只，1～3岁，体质量3.0 kg左右，购自中国医学科学院实验动物研究所实验动物资源北方中心。

整个动物接收过程需有兽医、动物供应商及实验人员三方共同在场确认。动物的接收、大体检查及传入等工作需详细记录在《动物中心实验动物接收、检疫记录表》中，表的主要内容包括实验名称、实验人员联系方式，动物接收时间，动物品种、品系及级别，接收动物的数量、性别、日龄或体质量，供应商信息、动物运输方式、运输条件、动物质量合格证的编号、动物运输包装的完整性、传入屏障区的房间号、房间负责人、传入屏障区的方式及传入人和兽医检查结果描述等信息。运输此美洲旱獭的运输笼具为木制运输箱箱内存放有垫料及饮水，保证动物在运输过程中的舒适度。接收工作结束后，兽医需对新进动物进行原位检疫。

根据风险评估的内容，个人防护应穿戴实验服、手套、医用口罩、护目镜，特别是为了防止动物抓伤咬伤，操作人员还需穿戴防咬手套。

1.4屏障设施内笼具饲养

饲养笼具及饲养房间在接收旱獭之前用1∶600浓度稀释的百毒杀进行喷雾消毒，待笼具干燥方可将旱獭放入。本次实验中使用的笼具为生物安全负压实验犬猴饲养系统笼具（图1）（美国Rockvill Steel& Manufacturing公司开发制造，6.0 Bio-Containment Module#1C-A4BC，PLC型）。该型号的负压抽吸系统，特别用于确保预设负压下的风机变速，确保动物笼内负压大于等于10 Pa，可以防止病原微生物的外泄，保证动物饲养设施内的生物安全。每个笼的大小为15.5立方英尺。笼具配备有锁式拉门、挤压板。采取每笼单只饲养模式。

1.5饲料及饲喂频率

结合美洲旱獭供应方饲养人员的经验，确定每日9∶00、15∶00定时饲喂。分别供给新鲜圆白菜50 g，兔饲料30 g，新鲜花生5 g。

1.6饲养间环境

饲养间内温度控制在22～26℃，相对湿度控制在40%～60%，光照为睡眠灯与黑暗8 h更换。饲养间的通风频率稳定在15次/h。

图1　饲养美洲旱獭笼具

2　美洲旱獭实验操作技术

2.1动物的抓取和保定

采用笼具保定法，即通过笼具挤压板缩小旱獭所处的空间，使其身体被固定在挤压板和笼具正面的狭小空间内，使其无法自由活动，以达到保定的效果。无需人工抓取，即可完成后肢肌肉注射麻醉剂的操作。

2.2动物标记

单只饲养，采用笼具插标签编号法。标签可置于笼位外表，包含的信息有实验名称，动物进驻时间，实验人员联系方式，动物体质量，日龄，以及动物编号等。

2.3实验操作前麻醉方法的确定

参照文献中推荐的麻醉药品及麻醉方法，即选用盐酸氯胺酮进行后肢肌肉注射，达到全身麻醉的效果，按照15 mg/kg、45 mg/kg、99 mg/kg体质量计算用药量，3种注射剂量均有效［8］。本次实验采用了45 mg/kg 体质量的给药量，显效时间为1～3 min，麻醉维持时间为20～40 min，之后美洲旱獭从抑制状态逐渐恢复， 1 h完全恢复正常状态。

2.4给药途径与方法

本实验给药途径为后肢内侧皮下小隐静脉注射给药，一次给药量为1.0 mL。

2.5血液采集

本实验根据实验人员需要的采血量，采用5 mL注射器在后肢内侧皮下小隐静脉采集血液，一次可采集2～5 mL。

2.6实验后护理

实验操作后，应待美洲旱獭完全苏醒后方可将旱獭送回原笼位，侧身卧位，保证旱獭呼吸通畅，饲养间的温度保持在22～26 ℃。确保旱獭得到充分休息和足够营养。兽医人员应密切关注动物状态，及时进行护理措施。

2.7动物安死术

本次实验采用深度麻醉与心脏采血相结合的方法对美洲旱獭施行安死术。具体操作为使用盐酸氯胺酮对美洲旱獭进行麻醉，用药量为99 mg/kg体质量。之后在负压解剖台上将旱獭仰卧保定，用注射器在心脏搏动最明显处进针采血，直至动物心跳呼吸停止为止。由于实验为甲型肝炎病毒的感染性实验，动物尸体表面以及排泄物应用体积分数1%次氯酸钠进行充分喷洒消毒，之后将动物尸体及其他废弃物分别装入医疗垃圾袋中封口，交由相关人员进行处理。

3　体会

美洲旱獭尚未成为我国的标准实验动物，与其他实验动物相比，有其特殊性。饲养过程中的各个环节都需经过实践摸索，得到经验。经人工驯养的美洲旱獭仍具有野外生存的特性，如凶猛，攻击性强等，这就需要研究人员在饲养笼具、饮食、实验技术操作、人员安全防护等方面不断探索，以总结出适合美洲旱獭饲养管理及实验操作的特定技术经验。

对于在2级动物饲养设施内开展的感染性实验，一定要注意风险评估工作的进行。确保参与到感染性实验的每个人员熟知各项风险因素，将风险程度降至最低。

［1］于海英，辛淑芳，王晓宁，等. 国内外实验动物科学发展动态［J］. 中国实验动物学杂志， 1999， 9（3）:1-4.

［2］Roggendorf M，Yang D， Lu M. The woodchuck: A model for therapeutic vaccination against hepadnaviral infection ［J］. Pathol Biol （Paris）， 2010， 58（4）:308-314.

［3］王山西. 旱獭人工养殖技术［J］. 农村实用技术， 2006， 4:56-57.

［4］范薇，王忠东，陶元清. 青海省野生动物实验动物化研究进展［J］. 实验动物科学与管理， 1997， 14（4）:60-63.

［5］李菁菁，陈乾生. 病毒性肝炎动物模型的研究［J］. 实验动物科学与管理， 1995， 12（3）:29-32.

［6］薛康宁，李晓燕，荣蓉，等. 动物生物安全二级实验室实验活动管理要点探讨［J］.实验动物科学， 2014， 31（5）:42-45.

［7］http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/hepa-eng. php#footnote1［DB/OL］.

［8］范薇. 喜马拉雅旱獭制动性麻醉方法［J］. 四川动物， 2008，27（6）:1139-1140.

Q95-33

1674-5817（2015）04-0320-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.014

2015-05-31

十二五科技重大专项（No.2012ZX10004-404）

薛康宁（1986-），女，研究实习员，硕士，从事实验动物兽医工作。E-mail: Xuekn@chinacdc.cn