现代分析技术在蜂蜜掺假鉴别中应用研究进展

吴燕涛，穆同娜，王绍清，于晓瑾，许玮

（国家食品质量安全监督检验中心，北京100094）

现代分析技术在蜂蜜掺假鉴别中应用研究进展

吴燕涛，穆同娜，王绍清，于晓瑾，许玮

（国家食品质量安全监督检验中心，北京100094）

介绍了质谱分析技术、色谱分析技术、光谱分析技术、热分析技术和同工酶分析技术等现代分析技术在蜂蜜掺假鉴别中的应用新进展，旨在为我国蜂蜜掺假鉴别新技术开发应用和相关职能部门的监管提供参考，对于规范国内蜂蜜市场秩序，促进蜂蜜市场的良性发展具有重要意义。

蜂蜜；掺假；鉴别；分析技术

蜂蜜作为一种天然营养食品，近年来需求量逐年增加，然而少数不法商人受利益驱动，蜂蜜掺杂使假的现象时有发生，极大损害了消费者利益，同时也影响了我国蜂蜜的出口。蜂蜜掺假、制假已成为目前蜂产业生产中不容忽视的问题。

GB 14963-2011《食品安全国家标准蜂蜜》[1]（以下简称“新国标”）于2011年10月20日正式实施，代替了GB14963-2003《蜂蜜卫生标准》[2]以及GB 18796-2005《蜂蜜》[3]中的对应指标，明确了蜂蜜的定义“蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质”，却未对蜂蜜真实性给出具体要求。GB 18796-2005《蜂蜜》于2012年4月20日起废止后转化为行业标准GH/T 18796-2012《蜂蜜》[4]（以下简称“新行标”），新行标中“真实性要求”条款明确指出“蜂蜜中不得添加任何当前明确或不明确的添加物；碳-4植物糖含量采用GB/T18932.1的方法试验时，试验结果X（蜂蜜中碳-4植物糖的百分含量）不得大于7。”蜂蜜标准的调整使得蜂蜜掺假及其鉴别技术研究在食品安全领域备受关注。

蜂蜜掺假鉴定技术随着掺假手段的发展也不断在发展，色谱分析技术、质谱分析技术、光谱分析技术及同工酶分析技术、差示扫描量热分析方法等其他更多的分析手段逐渐被应用于蜂蜜掺假鉴定研究领域。文中对现代分析技术在蜂蜜掺假鉴别中的应用及研究进行全面梳理和总结，旨在为新技术开发应用和相关职能部门的监管提供参考，对于规范国内蜂蜜市场秩序，促进蜂蜜市场的良性发展具有重要意义。

1 同位素质谱分析技术的应用

1.1 稳定性碳同位素比率法

目前稳定碳同位素比率法是检测蜂蜜掺假的标准技术，AOAC方法998.12《蜂蜜中碳-4植物糖含量-内标稳定碳同位素比率法》[5]采用稳定碳同位素方法鉴别蜂蜜中玉米糖浆和高果糖玉米糖浆。我国国家标准方法GB/T 18932.1《蜂蜜中碳-4植物糖含量测定方法稳定碳同位素比率法》[6]部分修改采用AOAC 998.12方法，被行业标准GH/T18796-2012《蜂蜜》指定用于蜂蜜真实性测定。

稳定性碳同位素比率法的主要理论基础是蜜源性植物主要是碳-3植物，其13C主要处于-21‰～32‰，远远低于碳-4植物的13C范围，-9.7‰～19‰。当蜂蜜中掺入碳-4植物糖时，蜂蜜的13C值（13CH）会随之升高，利用这一原理，可有效鉴别蜂蜜中掺入的碳-4植物糖浆，如玉米糖浆。这种方法在全世界鉴别蜂蜜中掺入碳-4植物糖浆方面的工作中做出了巨大贡献。该方法的不足之处是无法对低含量的碳-4植物糖浆掺假以及掺入碳-3植物糖浆，如大米糖浆、甜菜糖浆的掺假进行准确的判定[7]，通常被错误的判定为“纯蜂蜜”，这是由于低含量的碳-4植物糖浆和碳-3植物糖浆的加入，假蜂蜜的13CH升高并不明显所致。

1.2 液相色谱-同位素比值质谱法（LC-IRMS）

与稳定性碳同位素比率法相比，液相色谱-同位素比值质谱法（LC-IRMS）可更为准确的对掺假蜂蜜进行判定[8-9]。该方法是在元素分析-同位素比值质谱法（EA-IRMS）基础上进一步发展而来，蜂蜜样品经LC分离后，各个组分依次被氧化成CO2，通过IRMS在线测定各个组分的δ13C。这样弥补了之前离线方法的不足，可检测离线方法无法检测的C3糖和C3-C4混合糖，检测方法灵敏度也大大提高。

国外在该领域研究相对较早[10]，国内2011年开始有相关研究报道[11-12]。目前已在LC-IRMS和EA-IRMS的基础上建立了耦合元素分析仪/液相色谱-同位素比值质谱法（EA/LC-IRMS法）。Elflein等[10]采用EA/ LC-IRMS对451份纯蜂蜜样本进行分析，通过比较蛋白质和蜂蜜的δ13C差值，果糖和葡萄糖的δ13C差值，对用C3和C4植物源转化的糖浆掺假的蜂蜜样品进行判别，该法转化糖的检出限可达8%，远低于AOAC法的27%，还能够检测出蜂蜜中掺入的C3糖（大米糖浆）。费晓庆[11]采用EA/LC-IRMS法对蜂蜜掺假进行研究，通过比较蛋白质和蜂蜜的δ13C差值，果糖和葡萄糖的δ13C差值，认为纯正蜂蜜的δ13C值应该同时符合以下要求：Δδ13CP-H≥-0.95‰，-0.64‰＜Δδ13CF-G＜0.53‰，Δδ13Cmax≤2.09‰。对于不符合以上任何一项要求的蜂蜜，则判定为掺假蜂蜜。

2 色谱分析技术的应用

色谱分析技术已被广泛应用于各类物质的分离和分析，在蜂蜜掺假鉴别研究中，主要是运用气相色谱、液相色谱及其联用技术，针对蜂蜜中的不同糖分、类黄酮、多酚、有机酸、挥发性物质、氨基酸以及矿物质等来进行分析[13-14]，包括单组份检测和多组分的指纹图谱分析。

2.1 液相色谱及其联用技术

随着高效液相色谱技术的广泛应用，国外Kanenatsu等[15]（1983）首先采用HPLC法以寡糖模型检测蜂蜜中的HFS；1988年Lipp等[16]通过中压液相色谱技术（MPLC）与HPLC结合，进一步与TLC及同位素法相对比，建立了更为快速灵敏的HPLC法。1989年White等[17]又以蜂蜜中蛋白质为内标，通过蜂蜜的δ13C与其蛋白质的δ13C之差，判断蜂蜜中是否存在HFS掺假，此法较普通同位素法更为准确，检测灵敏度更高。Cordella等[18]采用高效离子交换色谱-脉冲安培检测器（HPAEC-PAD）对蜂蜜的糖分特征进行分析，结合化学计量法来区分不同种类蜂蜜的指纹图谱。研究指出线性区别分析（LDA）和人工神经网络（ANN）能很好的区分蜂蜜类别，鉴别准确率为93%和100%。由于玉米淀粉转换为玉米糖浆时，多聚糖不容易被酶水解转化，糖浆中存在少量多聚糖，而真蜂蜜中多聚糖很难检出或数量很低，可以将多聚糖作为标记物来鉴别蜂蜜是否掺假，Megherbi等[19]基于这一理论，采用HPAEC-PAD分析蜂蜜中添加玉米糖浆，将样品采用反相固相萃取去除单糖和少量低聚糖（DP3～6），浓缩多聚糖（DP11～17）后进行检测，该方法检出限可达1%。

国内从上世纪90年代开始将HPLC技术应用于蜂蜜掺假研究领域，通过采用示差检测器、蒸发光检测器等不同检测器，主要针对蜂蜜中掺入外源糖浆和蔗糖的掺假行为开展研究。

张存洁等[20]在国内较早将高效液相色谱应用于蜂蜜掺假研究，根据蜂蜜和高果糖浆（HFS）中的高寡糖不同，将样品经过活性炭-硅藻土层析柱分离、浓缩后，采用反向高效液相色谱示差检测器进行分析检测，HFS检测限可以达到2.5%，对同一种HFS掺入还可进行定量分析，比TLC省时省事，实验条件也易控制。弥补了传统AOAC法只能测定掺假10%的C4植物HFS的不足，在一定程度上可以替代AOAC中的TLC及同位素质谱法，但由于不同厂家生产的HFS，其植物来源不同，其中高寡糖含量也不完全相同，因此对所有HFS以同一标准进行定量分析，还存在一定困难，仍有待进一步研究解决。

2.2 气相色谱及其联用技术

不同植物来源的蜂蜜或添加了不同物质的假蜂蜜含有不同挥发性成分，气相色谱及其联用技术主要检测蜂蜜中的挥发性成分，从而可判定其植物来源、产地或者是否掺假[13]。Ruiz-Matute A I[21]等用GC和GC-MS对天然蜂蜜和利用HFCS、IS掺假的蜂蜜进行分析，样品经热处理，在掺假蜂蜜中能检测到二果糖酸酐（DFA），而在天然蜂蜜中检测不到DFA，认为DFA可作为标志物鉴别蜂蜜中是否掺入HFCS和IS。Doner LW[22]等用GC法通过测定麦芽糖和异麦芽糖的含量及二者之比来检测蜂蜜是否用HFCS掺假。Low NH等利用二糖和三糖的气相色谱指纹图谱，鉴别蜂蜜是否用转化糖（IS）掺假[23]。SanzM L[24]等利用GC-MS通过对蜂蜜中的16种二糖和9种三糖进行定性和定量检测，鉴别蜂蜜是否用糖浆掺假。近年来全二维气相色谱-飞行时间质谱在蜂蜜掺假研究领域也有报道[25-26]，并取得很好效果，主要用于区分不同植物来源蜂蜜掺假。我国尚未有采用该技术对蜂蜜掺假鉴别研究的报道，仅有缪恩铭等采用热裂解、冷进样系统和气质联用仪（Py-CIS-GC/MS）对蜂蜜样品热裂解及其产物进行比较分析，为蜂蜜掺假鉴别提供了一个很好的思路。

3 光谱分析技术的应用

3.1 红外光谱技术的应用

3.1.1 近红外光谱技术的应用

相对于中红外光谱技术，近红外光谱技术在蜂蜜品质检测领域研究开展较早，也较为深入。近红外光谱技术在蜂蜜掺假领域的应用主要是基于蜂蜜中有机化合物的C-H、N-H和O-H等有含氢基官能团在波长780 nm～2 500 nm范围内具有特征吸收的原理，结合化学计量法统计分析和建立模型，以达到对特征组分进行定性和定量分析的目的[14]。国外Downey和Kelly等[27]在2003年到2006年期间采用利用近红外光谱对掺入不同浓度和比例果糖、葡萄糖的蜂蜜样本开展了大量研究工作，采用κ-最邻近分类法（κ-NN）、软独立建模分类法（SIMCA）和判别偏最小二乘法（DPLS）进行建模判定分析。研究表明，DPLS是3种方法中最准确的方法，该法对纯蜂蜜的判别正确率为96%，对假蜂蜜的判别正确率为99%。

国内在2006年以后逐步开展近红外在蜂蜜掺假领域相关研究，张萍等[28]利用高果糖浆与洋槐花蜜混合配制成果糖含量不同的样品来模拟市售品质较差的蜂蜜样品，通过采集分析器近红外光谱，得出一阶导数处理后的光谱可以准确识别蜂蜜是否掺假。陈兰珍等[29]用傅里叶变换近红外光谱结合DPLS对掺假蜂蜜进行快速鉴别，与Downey研究结果一致，结论同样表明，假蜂蜜的识别率高于真蜂蜜的识别率。

李水芳等[30-31]在2010年后采用进红外光谱技术针对蜂蜜中葡萄糖浆和麦芽糖浆掺假展开研究，根据大量的样本检测，证明近红外光谱能实现蜂蜜掺杂葡萄糖的检测，建立了真假蜂蜜的定性判别模型和掺假量的定量校正模型。CARS-PLS-DLA模型对真假蜂蜜判别正确率达到100%，CARS-PLS定量校正模型对掺假量的定量分析结果也较为满意。对用麦芽糖浆掺假蜂蜜进行研究，发现真假蜂蜜定性判别的最优光谱预处理方法为加自归一化，定量分析的最优光谱预处理方法为自归一化。

屠振华等[32]应用近红外反射光谱分析技术，研究建立蜂蜜中是否含有常见的果葡糖浆和果糖、葡萄糖类掺假物质的近红外定性识别分析模型，结果表明，在800 nm～2 500 nm区间，无法通过全谱区域或者是某一谱区范围内光谱的形状及位置的差异来简单判别蜂蜜是否掺入掺假物质，运用主成分得分空间分布也无法区分掺入掺假物质的情况，采用最小二乘支持向量机方法时候，2种掺假情况下样品集的校正集和验证集的正确判别率均达到100%。

由文献报道可见，近红外光谱技术在蜂蜜掺假鉴别领域已取得一定的突破，但由于所涉及蜂蜜品种和来源较为单一，同时模拟掺假的情况和掺假量与实际情况仍存在一定差异，将其真正用于实际蜂蜜掺假鉴别中，还需要在有效提取和利用有效信息、提高预测精度等方面开展进一步研究，同时充分考虑蜂蜜的品种分布、掺假情况和掺杂手段、掺假物质含量及比例等诸多因素。

3.1.2 中红外光谱技术的应用

中红外光谱技术在蜂蜜掺假鉴别领域，主要是利用中红外光谱信息结合LDA和ANN等化学计量学方法，针对蜂蜜中掺入果糖、葡萄糖、还原糖、玉米糖浆等现象开展研究，就现有文献报道来看，中红外光谱分析技术可用于蜂蜜掺假现象的判别，整体判别准确率较高。但现有研究中采用化学计量学方法多为LDA和PCA，聚类分析方法等常规性研究方法，如能运用在近红外光谱技术中采用的化学计量方法如DPLS、SIMCA以及SVM等方法来进行掺假鉴别，将能更好提高中红外光谱分析技术在蜂蜜掺假鉴别中的适用性。

Kelly等[33]采用中红外光谱结合PLS和SIMCA算法对掺有转化甜菜糖浆、HFCS、部分转化甘蔗糖浆的掺假样品进行分析，研究表明，掺有甜菜蔗糖、葡萄糖浆和部分转化甘蔗糖浆的掺假蜂蜜的判别正确率均在90%以上，而对掺有HFCS和转化甜菜糖浆的掺假样品判别正确率较低，仅达到75.0%和71.4%，无法进行有效掺假鉴别。

国内梁奇峰等[34]利用傅里叶红外光谱技术对不同品种纯蜂蜜与掺假蜂蜜进行分析，研究发现，纯蜂蜜的红外光谱基本相同；掺有葡萄糖、黄糖和蔗糖的蜂蜜样品在波数1 200 cm-1～900 cm-1和600 cm-1～400 cm-1处的吸收峰与纯蜂蜜有突出的区别特征，据此可实现纯蜂蜜和葡萄糖、黄糖、蔗糖掺假蜂蜜的鉴别。赵延华等[35]利用衰减全反射傅里叶红外光谱法对掺入蔗糖、葡萄糖和果葡糖浆的蜂蜜进行分析，结果表明，对掺入蔗糖和葡萄糖的蜂蜜特征吸收峰进行多峰位比较，判定是否掺假；对掺入果葡糖浆的蜂蜜红外谱图，通过比较二阶导数图谱在1 054 cm-1、817 cm-1两处的吸收峰，可以准确判定是否掺入果葡糖浆，最小检出限量为10%

3.2 荧光光谱技术的应用

蜂蜜中的多酚和氨基酸等物质可以产生荧光，以氨基酸作为标记物，国外已采用前表面荧光光谱技术针对蜂蜜产地、植物来源鉴别开展了大量研究[36-37]，Ruoff等[38]将此技术应用于蜂蜜品种的真实性分析。国内尹春玲[39]首先将荧光光谱技术应用于蜂蜜的辨别分析中，她采用二维荧光结合主成分分析方法对蜂蜜的掺假现象进行了定量研究，涉及蜂蜜品种主要为枣花蜜和洋槐蜜。研究中应用二维荧光结合主成分分析方法对蜂蜜中的掺假现象进行了模式识别研究，掺伪蜂蜜通过在纯蜂蜜中加入不同比例糖浆配置。每种纯蜂蜜和掺假蜂蜜样品在波长300 nm～800 nm之间扫描发射光谱，每隔5 nm取一个数据，狭缝宽度为5.0/5.0 nm。结果表明，纯蜂蜜和掺假蜂蜜的发射光谱在430 nm左右会发生微小波动，但从谱图中仍然很难区别开蜂蜜的真假，通过对这些数据进行主成分分析，可清楚区别真假蜂蜜。

3.3 拉曼光谱技术的应用

拉曼光谱属于散射光谱，是研究分子振动的一种光谱方法，与红外光谱相比，更适合于对含水的生物系统进行在线分析。拉曼光谱技术在国外应用较早，Paradkar等[40]2001年时，就采用傅里叶变换拉曼光谱技术，根据蜂蜜掺假样品的特征吸收带，结合化学计量法，对甘蔗转化糖浆和甜菜转化糖浆掺假的蜂蜜进行鉴别，鉴别准确率达96%。我国在该领域研究相对较晚，2011年张欣等[41]基于拉曼光谱技术采用airPLS法对蜂蜜的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量进行定量研究，找到四种糖的最佳测量模式，认为拉曼光谱技术可以快速分析蜂蜜中果糖和葡萄糖含量，对于蔗糖和麦芽糖的研究有待进一步研究。2012年李水芳等人又在已有研究基础上，对拉曼光谱结合化学计量法鉴别蜂蜜掺假的能力进行检验，研究中共收集10种常见植物来源的74个蜂蜜样本和74个甜菜糖浆掺假蜂蜜样本，认为自归一化法是最好的光谱预处理方法，air-PLS法能有效扣除拉曼荧光背景，提高预测精度[42]。

3.4 紫外-可见吸收光谱技术的应用

紫外-可见吸收光谱属于分子吸收光谱，是由于价电子的跃迁而产生，利用不同有机化合物对紫外和可见光产生的紫外可见吸收光谱及吸收程度的差异可以对物质的组成、含量和结构进行分析、测定和推断，目前在蜂蜜掺假领域应用较少，鲜有报道。欧文娟等[43]采用紫外-可见吸收光谱技术结合主成分分析-反向传播人工神经网络，对掺假蜂蜜进行鉴别研究，实验采集了纯正蜂蜜、掺假5%～20%的蜂蜜样品和100%掺假样品在紫外-可见波段220 nm～750 nm的吸收光谱，并对最佳敏感波段250 nm～400 nm的吸光度值进行主成分分析（PCA），优选主成分作为反向传播人工神经网络（BPANN）的输入向量。输出结果显示，校准集和预测集的准确鉴别率均为100%；对应的均方根误差分别为8.253×10-3和8.961×10-3。研究结果表明，基于主成分分析-反向传播人工神经网络的紫外-可见吸收光谱技术作为一种蜂蜜掺假鉴别手段可实现蜂蜜掺假鉴别，可为蜂蜜掺假的快速检测提供参考。

4 其他分析技术

4.1 显微镜技术的应用

显微镜技术在蜂蜜掺假判别中应用主要通过以下几种途径实现：一是基于纯蜂蜜中都会含有蜜源植物花粉且每种单一品种蜂蜜都有其特定的花粉及花粉图谱，借助显微镜观察蜂蜜中存在花粉的品种、数量和主要品种花粉所占百分比，以确定蜂蜜的品种和纯度，进而判定蜂蜜是否掺假[44-45]；二是基于纯蜂蜜中通常会含有少量淀粉颗粒，而掺入饴糖或淀粉转化糖就可能存在大量淀粉颗粒，通过显微镜观察蜂蜜中存在淀粉颗粒的数量、特征来判断蜂蜜是否掺假[46]；三是针对蔗糖及蔗糖制品掺假的蜂蜜，借助显微镜观察蜂蜜中是否含有蔗糖碎片，通过观察蔗糖碎片（薄壁细胞、单细胞环和表皮细胞）数量、特征，以判断蜂蜜是否掺假[47-48]。

目前显微镜检测技术在蜂蜜掺假领域主要用于蔗糖和蔗糖制品掺假的蜂蜜鉴别，不适用于玉米糖浆掺假蜂蜜的鉴别[47-48]。由于可以采用过滤的方法减少掺假蔗糖中的细胞碎片，这给显微镜鉴别蔗糖掺假蜂蜜带来一定难度，另外显微镜鉴别技术通常需要良好的专业基础知识，对前处理技术要求也非常高，所以显微镜检测方法虽然简单便于操作，但较难推广，可作为蜂蜜掺假鉴别的辅助检测手段之一，对于淀粉糖和含淀粉糖蜂蜜的显微镜检查值得深入研究。

4.2 差示扫描量热法（DSC）

DSC作为一种热分析方法，由于具有分辨率高、灵敏度高、快速、所需样品量少等优点，近年来被越来越多的应用于食品品质分析、掺假分析以及质量控制。根据纯蜂蜜和掺假糖浆的热力学特征，通过测定天然蜂蜜与掺假蜂蜜的玻璃化转变温度（Tg）、溶化焓（ΔH）和热容（ΔCp）等热力学参数，来判断蜂蜜是否掺假。Cordella等[49]采用DSC测定了甜菜糖浆、甘蔗糖浆、糖类代用品等掺假物，以及槐花蜜、薰衣草花蜜和枞树蜜的热力学特征曲线，结果表明，DSC发可检测蜂蜜中掺入的糖浆，基于糖浆的类型，方法检出限在5%～10%之间，但对于糖类代用品掺假和枞树蜜中糖浆掺假则不易检出。

4.3 同工酶分析技术

有研究表明，蜂蜜中的淀粉酶来源于蜜蜂，而不是花粉[50-51]。因此，以淀粉酶作为蜂蜜掺假鉴别的特征指标之一，可以对其他掺假鉴别方法进行有效补充。国内外围绕淀粉酶对蜂蜜掺假鉴别进行了大量研究，但都以淀粉酶活性的有无和变化情况作为主要研究内容，无法对掺入耐高温、活性强工业淀粉酶的假蜂蜜进行有效判别。

每种淀粉酶都有自己特有的同工酶图谱，蜂蜜产品中如掺有其他来源的淀粉酶则其同工酶图谱与天然蜂蜜应该有所不同。叶云[52]通过对两种天然蜂蜜与掺假所用的工业淀粉酶的同工酶电泳比较，发现工业淀粉酶和天然蜂蜜的淀粉酶的同工酶条带存在差异，证明可以通过淀粉酶同工酶电泳的方法来检测蜂蜜产品质量、以及蜂蜜掺假，为蜂蜜掺假鉴别提供了一种新思路。

5 结语

随着造假技术的不断发展，蜂蜜中添加的掺假成分越来越复杂，掺假用的糖分来源也日趋多样化，单一的检测技术很难保证检测结果的准确性，多种方法联合检测技术、混合蜂蜜确证技术将成为蜂蜜掺假鉴别研究领域的研究方向。

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Review of Modern Analysis Technique Used in Identification of Adulterated Honey

WUYan-tao，MU Tong-na，WANGShao-qing，YUXiao-jin，XUWei
（ChinaNational Food Quality Safety Supervision and Inspection Center，Beijing100094，China）

In order to provide some references to explore a new approach to identify the honey quality and adulteration，modern instrumental analysis for honey adulteration were reviewed in this paper，includingmass spectrum analysis，chromatogram analysis，spectroscopy analysis，thermal analysis and isozyme analysis.It will be important to regulate the order of honey market and promote the prosperous development of honey industry.

honey；adulteration；identification；analysis technique

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.033

2013-09-29

国家质检总局科技计划项目（No.2010QK010）

吴燕涛（1981—），女（汉），高级工程师，博士，研究方向：食品生物技术。