泽泻滴丸的质量控制标准

温秀萍，许 文，，李小艳，洪海棉，，丘建芳，赵万里，黄鸣清，宋 煜，吴水生

(1.福建中医药大学生物医药研发中心，福建福州350122； 2.福建中医药大学药学院，福建福州350122)

·方与药·

泽泻滴丸的质量控制标准

温秀萍1，许 文1，2，李小艳2，洪海棉1，2，丘建芳2，赵万里2，黄鸣清2，宋 煜2，吴水生2

(1.福建中医药大学生物医药研发中心，福建福州350122； 2.福建中医药大学药学院，福建福州350122)

目的 建立泽泻滴丸的质量标准。方法 用薄层色谱法对泽泻滴丸进行定性鉴别，用紫外-可见分光光度法测定泽泻滴丸总三萜含量，用高效液相色谱法，Ultimate XB-C18色谱柱：4.6 mm×150 mm，5 μm；流动相：乙腈-水(65∶35)；流速：1 mL/min；检测波长：208 nm，测定23-乙酰泽泻醇B的含量。 结果 薄层色谱图中可以检出泽泻的特征斑点，UV-Vis法含量测定，香草醛-高氯酸显色，总三萜以23-乙酰泽泻醇B计，浓度在5.97～15.92 μg/mL与吸光度值呈良好线性关系，平均加样回收率97.08%，RSD 3.75%，HPLC法测定23-乙酰泽泻醇B的浓度在9.88～59.28 μg/mL，与峰面积呈良好线性关系、平均加样回收率98.04%，RSD 2.20%。 结论 薄层色谱法、UV-Vis法、HPLC法简便，准确，专属性强，重复性好，可有效控制泽泻滴丸的质量。

泽泻滴丸；薄层色谱；紫外-可见分光光度法；高效液相色谱法；23-乙酰泽泻醇B

从上世纪60年代至今，国内外学者从泽泻中分离得到的化学成分有近百种，以原萜烷型四环三萜类成分为主要成分[1]。现代药理学研究表明，泽泻中三萜类化合物是其降血脂、抗动脉粥样硬化、抗脂肪肝、降糖的主要药效成分[2-5]，含量较高的三萜成分23-乙酰泽泻醇B，被中国药典、日本药典收载作为泽泻药材含量测定的指标。我们课题组前期已经考察了泽泻总三萜提取物制剂泽泻滴丸成型工艺[6]及加速稳定性[7]，泽泻滴丸药效学研究表明泽泻滴丸具有抗炎、利尿、降血脂、抗脂肪肝功效，长期毒性试验、急性毒性试验、一般药理学研究表明泽泻滴丸安全无明显毒副作用[8]。为了泽泻滴丸应用的安全有效，我们研究泽泻滴丸的质量标准，为其质量控制提供实验依据。

1 仪器与试药

LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；UV9100紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)；DV-2150CD型十万分之一分析天平(美国奥豪斯公司)；KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)；Goodsee-II型薄层色谱摄影仪(上海科哲生化科技有限公司)；色谱乙腈(德国默克公司)；其它所用试剂均为分析纯。泽泻滴丸(福建中医药大学药学院自制，批号：中试2011001、中试2011002、中试2011003)；23-乙酰泽泻醇B对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111846-201102)。

2 方法与结果

2.1 性状 本品为棕色到棕黑色滴丸，气微香，味苦。

2.2 薄层鉴别 取本品0.1 g，加乙腈1 mL，超声处理20 min，0.45 μm滤膜滤过，滤液加于氧化铝柱(200～300 目，5 g，内径1 cm，干法装柱)上，用乙酸乙酯10 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使之溶解，作为供试品溶液。取23-乙酰泽泻醇B对照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验，移取上述2种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G板上，以环己烷-醋酸乙酯(1∶1)，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸-乙醇溶液，105 ℃加热显色至斑点显色清晰。供试品色谱中，于对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。3批中试泽泻滴丸薄层鉴别结果见图1。斑点1、2、3为泽泻滴丸，4为对照品23-乙酰泽泻醇B，5为阴性空白滴丸。

注：A.中试2011001；B.中试2011002；C.中试2011003。

2.3 总三萜含量测定

2.3.1 供试品溶液制备 精密称取泽泻滴丸60 mg，置25 mL瓶中，加适量乙腈超声溶解，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取23-乙酰泽泻醇B对照品5 mg，加乙腈25 mL制成每1 mL含0.2 mg对照品溶液，即得。

2.3.3 阴性样品溶液制备 精密称取泽泻阴性滴丸(聚乙二醇辅料做成的滴丸)60 mg，置25 mL瓶中，加适量乙腈超声溶解，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。2.3.4 测定波长选择 分别精密移取对照品、供试品、阴性溶液各200 μL于3个5 mL瓶中，水浴挥干，精密加入新鲜配制的5%香草醛-冰醋酸0.2 mL、高氯酸0.8 mL，混匀，密塞，置60 ℃水浴中加热15 min，取出，冰浴5 min停止反应，取出放至室温，用冰醋酸定容至刻度，混匀。三者分别以同法处理的空白显色体系为参比，在410～800 nm波长处扫描。结果对照品与供试品紫外吸收基本一致，最大吸收波长在555 nm，阴性样品在波长400～800 nm处无吸收，在555 nm处不干扰测定总三萜含量，故选择555 nm为比色测定波长。

2.3.5 显色条件考察 显色的温度、高氯酸量、5%香草醛量、显色时间对显色反应有影响。香草醛量和反应时间对显色影响不大，温度和高氯酸量对显色影响较大。温度越高，吸光度值越大，高氯酸量越大，吸光度值也越大。经过优化最终选择显色条件为：60 ℃、高氯酸0.8 mL、5%香草醛0.2 mL、显色时间15 min。

2.3.6 方法学考察

2.3.6.1 标准曲线绘制 分别精密移取对照品溶液150、200、250、300、350、400 μL加入6个5 mL瓶中，水浴60 ℃挥干溶剂，按2.3.5项显色，以同法处理的空白显色体系为参比，在555 nm波长处测吸光度，以吸光度对浓度进行回归计算，得回归方程：

Y = 0.0496 X - 0.0408 r=0.999 2

表明23-乙酰泽泻醇B的浓度在5.97～15.92 μg/mL与吸光度值呈线性关系。

2.3.6.2 精密度实验 精密量取对照品溶液和供试品溶液各200 μL于5 mL瓶中，60 ℃水浴空气吹干溶剂，按2.3.5项显色后在紫外分光光度计上连续测定6次，结果对照品溶液和供试品溶液RSD为0.17%、0.25%。

2.3.6.3 稳定性实验 精密量取对照品溶液和供试品溶液各200 μL于5 mL瓶中，按2.3.5项显色后，在120 min室温下每隔5 min测定吸光度1次。结果表明供试品和对照品显色产物在室温下90 min内稳定，RSD为2.14%、2.73%。

2.3.6.4 重复性实验 精密称取同批(批号：中试2011001)泽泻滴丸6份，按2.3.1项制成供试品溶液，按2.3.5项显色后测定吸收度并根据标准曲线计算，结果该批滴丸总三萜百分含量平均值为12.07%，RSD 2.05%，说明重复性良好。

2.3.6.5 中间精密度试验 分别由A、B、C 3人，分别取同批供试品3份，在不同的时间，用同一台设备测定，A、B、C 3人测定结果为11.98%、12.04%、12.09%，RSD为1.85%、1.92%、2.67%，结果表明中间精密度良好。

2.3.6.6 加样回收实验 精密称取同一批次已知含量的泽泻滴丸(重复性实验批次)30 mg，共6份，另取23-乙酰泽泻醇B对照品，按对照品∶样品中总三萜1∶1加入按2.3.1项制备供试品溶液，按2.3.5项显色后测定，结果见表1。

表1 加样回收率实验

2.3.7 3批中试泽泻滴丸含量测定 精密称取3批中试泽泻滴丸各60 mg，按2.3.1项制备供试品并按2.3.5项显色，以相应的空白试剂为参比，测定吸光度，并计算滴丸总三萜百分含量。结果3批泽泻滴丸含总三萜为12.09%、11.97%、12.08%，RSD为0.48%、1.11%、0.30%。

2.4 23-乙酰泽泻醇B含量测定

2.4.1 供试品溶液的制备 精密称取泽泻滴丸20 mg，置25 mL瓶中，加入乙腈适量，超声处理使之溶解，取出，放冷，加乙腈至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。阴性样品同法制备。

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取23-乙酰泽泻醇B对照品12.35 mg，置于25 mL瓶中，加乙腈稀释至刻度，制成每1 mL含494 μg的溶液，即得。

2.4.3 色谱条件 Ultimate XB-C18色谱柱：4.6mm×150mm，5 μm；流动相：乙腈-水(65∶85)；检测波长：208 nm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃。色谱图见图2～图4。

图2 对照品HPLC色谱图

图3 供试品HPLC色谱图

图4 阴性样品HPLC色谱图

2.4.4 方法学验证

2.4.4.1 线性范围 取23-乙酰泽泻醇B母液，用乙腈稀释成9.88、19.76、29.64、39.52、59.28 μg/mL梯度浓度标准溶液，分别进样10 μL分析，记录峰面积，以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制23-乙酰泽泻醇B标准曲线，得线性方程：

Y = 9982 X + 2452 r=0.9999

线性范围9.88～59.28 μg/mL。

2.4.4.2 精密度实验 取同份23-乙酰泽泻醇B对照品连续进样6次，计算峰面积RSD为0.78%，说明精密度良好。

2.4.4.3 稳定性实验 取同份样品分别于0、2、4、8、24 h进行测定，记录标准品的峰面积，计算RSD为3.67%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定，稳定性良好。

2.4.4.4 重复性实验 精密称取同一批次滴丸样品6份，制备样品，进样分析，根据标准曲线计算百分含量，该批滴丸中23-乙酰泽泻醇B平均百分含量为2.004%，RSD为2.58%，结果表明重复性良好。

2.4.4.5 中间精密度试验 由A、B、C 3人，分别取同批供试品3份，在不同的时间，用同一台设备，按含量测定方法测定，A、B、C 3人测定结果分别为1.998%、1.994%、2.002%，RSD为1.55%、0.93%、1.27%，结果表明中间精密度良好。

2.4.4.6 加样回收实验 精密称取同一批次已知含量的泽泻滴丸(重复性实验批次)10 mg，共6份，另取23-乙酰泽泻醇B对照品，按对照品：样品中23-乙酰泽泻醇B量1∶1加入，制备供试品溶液，分别测定，结果见表2。

表2 加样回收率实验

2.4.5 3批中试样品含量测定 精密称取3批中试泽泻滴丸各20 mg，分别制备供试品并测定。根据标准曲线计算滴丸23-乙酰泽泻醇B百分含量，3批中试滴丸含量测定结果表明三批泽泻滴丸含23-乙酰泽泻醇B含量分别为2.053%、1.998%、2.185%，RSD为2.74%、2.27%、2.03%。

3 讨 论

3.1 本实验薄层鉴别参考2010版药典泽泻药材方法，比较了样品制备、展开剂、显色剂、点样量、硅胶类型，最终选择与药典一致的样品制备方法及展开剂，但是显色剂比较5%硅钨酸乙醇、5%香草醛-硫酸、10%硫酸-乙醇溶液后发现，10%硫酸乙醇显色优于药典的5%硅钨酸乙醇，最终选择10%硫酸乙醇显色。

3.2 本实验建立UV-Vis法测定泽泻滴丸中总三萜含量方法，经线性范围、精密度、稳定性、重复性、回收率考察，结果符合分析要求。3批中试泽泻滴丸的总三萜含量为12.09%、11.47%、12.98%，平均含量为12.18%，以中试实际保留率的80%计算，本品中总三萜含量限度暂定为每g滴丸中含总三萜量以23-乙酰泽泻醇B计不低于97.4 mg。

3.3 本实验建立的高效液相色谱法测定泽泻滴丸中23-乙酰泽泻醇B含量，方法经线性范围、精密度、稳定性、重复性、回收率考察，符合分析要求。3批中试泽泻滴丸的含量为2.053%、1.998%、2.185%，平均含量为2.078%，以中试实际保留率的80%计算，本品中23-乙酰泽泻醇B含量限度暂定为每1 g滴丸不低于16.6 mg。本实验建立泽泻滴丸质量标准性状、鉴别、含量测定，方法快速、简便，可为泽泻滴丸的质量控制提供实验依据。

[1]XIN L，SONG L L，YAN Z，et al. Characterization of protostane triterpenoids in Alisma orientalis by ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-fight mass Spectrometry[J]. Rapid communications in mass spectrometry，2010，24(11)：1514-1522.

[2]秦建国，王亚红，梁晋普.泽泻萜类化合物对ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠肝脏基底膜HSPG的调节作用[J].中华中医药学刊，2007，25(4)：696-698.

[3]许文，郑春松，吴水生.计算机模拟筛选泽泻降血脂作用的化学成分[J].福建中医学院学报，2010，20(3)：34-36.

[4]LIN HSIANG-RU. Triterpenes from Alisma orientalis act as farnesoid X receptor agonists[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2012，22(14)：4787-4792.

[5]LI QIN，QU HAI-BIN. Study on the hypoglycemic activities and metabolism of alcohol extract of Alismatis Rhizoma[J]. Fitoterapia，2012，83(6)：1046-1053.

[6]宋煜，吴水生，林建春，等.泽泻滴丸成型工艺优选[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(8)：28-30.

[7]赵万里，丘建芳，洪海棉，等.泽泻滴丸的加速稳定性研究[J].福建中医药大学学报，2014，24(1)：30-32.

[8]HUANG M Q，XU W，WU S S，et al. A 90-day subchronic oral toxicity study of triterpene-enriched extract from Alismatis Rhizoma in rats[J]. Food Chem Toxicol，2013(58)：318-323.

2014-09-12

国家自然科学基金资助课题(1205022)；国家“十二五”科技支撑计划资助课题(2011BAI01B06)；福建省自然科学基金资助课题(2014J01352)；福建省卫生厅青年科研资助课题(2013-2-55)；福建中医药大学校管课题(X2012023)

温秀萍(1984—)，女，研究实习员，主要从事药用植物种质资源研究。

R917

A

1000-338X(2015)03-0031-03