FOXP3及ROR-γ转录因子在非重型再生障碍性贫血的意义及与肾虚证的相关性

胡明辉，胡令彦，周永明，陈海琳

(上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海200437)

·学术探讨·

FOXP3及ROR-γ转录因子在非重型再生障碍性贫血的意义及与肾虚证的相关性

胡明辉，胡令彦，周永明，陈海琳

(上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海200437)

目的 研究FOXP3、ROR-γ转录因子在非重型再生障碍性贫血(NSAA)中的意义及与肾虚分型的相关性。 方法 收集CAA患者102例，用RT-PCR方法检测FOXP3及ROR-γ转录因子水平，与正常对照组比较。 结果 与正常对照组比较，FOXP3mRNA、ROR-γtmRNA表达水平高于正常对照组； ROR-γt mRNA在肾虚组间比较有差异，肾阴虚组>肾阳虚组>肾阴阳两虚组(P<0.05)；ROR-γt mRNA与肾虚分型有相关性，P<0.01。 结论 FOXP3、ROR-γ转录因子与NSAA发病有一定相关性，主要异常发生在ROR-γ转录因子之间的调控，中医肾虚分型与转录因子有相关性。

非重型再生障碍性贫血； FOXP3转录因子； ROR-γ转录因子； 肾虚证

再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)是由各种原因引起的骨髓造血功能的衰竭，其特征为全血细胞减少。T细胞介导的细胞免疫是AA重要发病机制，AA患者活化状态T细胞的增加是其免疫病理机制的生物学基础[1]。近年新发现Th17/CD4+CD25+Treg失衡在再障免疫发病过程中的地位日益显著[2]，而其失衡的表现并不能单以Th17及Treg细胞水平来表达，其对免疫紊乱的作用较大程度取决于其转录因子水平的变化。我们就Th17及Treg细胞的相关转录因子FOXP3及ROR-γ在NSAA中的影响作一研究，并分析其与中医肾虚分型的相关性。

1 临床资料

1.1 病例选择标准

1.1.1 西医诊断标准[3]① 血常规检查：全血细胞减少，校正后的网织红细胞比例

1.1.2 AA分型 重型AA诊断标准(Camitta标准)：① 骨髓细胞增生程度<正常的25%；如≥正常的25%但<50%，则残存的造血细胞应<30%。② 血常规：需具备下列3项中的2项：ANC<0.5×109/L；校正的网织红细胞<1%或绝对值<20×109/L；BPC<20×109/L。③ 若ANC<0.2×109/L为极重型AA。非重型AA诊断标准(NSAA)：未达到重型标准的AA。

1.1.3 中医证候分型标准 按照1989年6月在大连召开的中国中西医结合研究会血液病专业委员会第三届第二次学术座谈会制订的辨证分型标准。① 肾阴虚证：主症：心悸，头晕，周身乏力，面色口唇指甲苍白，盗汗，出血，次症：低热，手足心热，口渴思饮，大便干结，舌质淡或舌尖红，苔薄，脉细数。② 肾阳虚证：主症：心悸，头晕，周身乏力，面色口唇指甲苍白，形寒肢冷，腰膝酸软。次症：性功能减退，大便溏，多无出血或出血轻微，舌质淡，脉沉细或虚大。③ 肾阴阳两虚证：除有血虚证侯外，兼有以上肾阴虚及肾阳虚证候。

1.2 一般资料 选择上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院2011年3月-2013年3月的门诊和住院NSAA者102例，辨证分为肾阴虚型、肾阳虚型、肾阴阳两虚3组，见表1。

2 方法

2.1 实验方法 FOXP3、ROR-γ转录因子采用实时荧光定量PCR法检测，由上海博彩生物公司提供的引物DEPC、NTP。分离外周血单个核细胞(BMMNC)，进行总RNA的提取，对所提取RNA进行鉴定。TRIzol抽提细胞总RNA，按说明书进行反转录，逆转录合成cDNA，逆转录反应产物保存于-20°冰箱备用。PCR引物由上海生物工程技术服务有限公司设计合成。PCR扩增后产物在琼脂糖凝胶上110V电压条件下电泳45min，溴化乙锭染色，数码凝胶图像分析系统作条带密度扫描，结果以bcl-6与内参照的灰度比值表示。

表1 3组一般情况

3 结 果

实验结果 见表2、表3。

表2 2组FOXP3mRNA、ROR-γtmRNA水平比较

注：与正常组比较，1)P<0.05。

表3 3组FOXP3mRNA，ROR-γtmRNA水平比较

注：与肾阴虚组比较，1)P<0.05。

3.2 ROR-γt mRNA 与FOXP3 mRNA比值 Th17与Treg的特异性转录因子ROR-γt mRNA 与FOXP3 mRNA在NSAA患者中均有升高，但二者比值NSAA组ROR-γt mRNA/FOXP3 mRNA较正常组明显升高。

3.3 肾虚分型与转录因子相关性 为探索NSAA肾虚分型与转录因子相关性，行Spearman相关性分析，结果提示ROR-γt mRNA与肾虚分型有相关性，r=-0.286，P<0.01。FOXP3 mRNA转录因子与肾虚分型无相关性。

4 讨 论

4.1 Th17/Treg免疫失衡与NSAA免疫发病关系被很多研究所证实。Treg的免疫表型为表达细胞内转录因子FOXP3，有研究证实AA患者胞内转录因子FOXP3表达也明显下调[4]。但Th17细胞分化与CD4+CD25+Treg细胞诱导存在相互排斥的关系，孤儿核受体ROR-γt是Th17细胞系特异的转录因子，当较高浓度的IL-6存在时，可诱导转录因子ROR-γt表达，使初始CD4+T细胞分化为Th17

细胞[5]。本课题组[6]已证实Thl7与Treg细胞比例和正常对照组比较差异有统计学意义，Treg细胞低于对照组，Thl7细胞高于对照组，Thl7/Treg水平明显高于正常人。Fujisawa 等[7]研究结果表明造血干细胞RORγt表达上调，可以诱导Th17细胞分化，但能同时增加Treg细胞数量。结果的矛盾促使我们从转录因子层面去进一步探讨其作用机制。本试验结果显示，转录因子FOXP3mRNA、ROR-γtmRNA表达水平显著高于正常对照组，NSAA组ROR-γt mRNA/FOXP3 mRNA较正常组明显升高，使得最终导致Th17/Treg的升高，从而发生Th17/Treg免疫紊乱的状态。

4.2 在与中医肾虚相关性的研究结果显示ROR-γtmRNA在肾虚组间比较有差异，肾阴虚组>肾阳虚组>肾阴阳两虚组，这与既往研究中肾阴虚Th17细胞比例升高有关联，提示肾阴虚在Th17细胞比例升高方面的特征存在。Th17/Treg相关转录因子在不同肾虚分型中的差异主要存在ROR-γtmRNA中。中医理论认为“邪之所凑，其气必虚”，虽然再障以肾虚为本，但发病之初或发病过程中，风邪、湿热等邪毒是作为疾病发生、发展、恶化环节中的重要因素，我们认为Th17及其相关转录因子、细胞因子的紊乱或过度表达而发生的免疫亢进与NSAA患者发病过程中在正虚基础上发生邪毒侵犯，导致疾病发生有高度相关性。

[1]YOUNG NS，BACIGALUPO A，MARSH JC． Aplastic anemia：pathophysiology and treatment[J]． Biol Blood Marrow Transplant，2010，16：119-125．

[2]王宁玲，王敏，王会平，等.再生障碍性贫血患儿外周血Treg/Th17细胞失衡的研究[J].中国小儿血液与肿瘤杂志，2014，19(4)：202-205.

[3]中华医学会血液学分会红细胞疾病学组． 再生障碍性贫血诊断治疗专家共识[J].中华血液学杂志，2010，31(11)：790-792.

[4]SHEVACH E M． CD4CD25suppressUrT cells：More questions than aIl-swels[J]． Nat Rev hnmunol，2002,2(6)：389-400．

[5]YANG XO，PAPPU BP，NURIEVA R，et al.T helper 17 lineage differentiation is programmed by orphan nuclear trceptors ROR alpha and ROR gamma[J]. Immunity，2008,28(1)：29-39.

[6]胡令彦，周永明，陈英坤，等. 非重型再生障碍性贫血患者Thl7/Treg比例及相关细胞因子白细胞介素-6、-17和转化生长因子β1水平的临床意义[J]. 临床内科杂志，2013，30(9)：636-639.

[7]FUJISAWA Y，NABEKURA T，KAWACHI Y，et al． Enforced ROR-γ expression in haematopoietic stem cells increases regulatory T cell number，which reduces immunoreactivity and attenuates hypersensitivity in vivo[J].Asian Pac J Allergy Immunol，2011,29(1)：86-93.

2014-10-25

国家自然科学基金资助课题(81001510)

胡明辉(1975-)，女，医学博士，副主任医师，主要从事中医药治疗血液病的研究。

R556

A

1000-338X(2015)03-0001-02