实时荧光定量PCR技术原理及在食品检测中的应用*

程海星，郭月英，任霆，张静，王乐，张利霞，靳烨

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特，010018)

近年来，实时荧光定量PCR技术因其独特的优点，被广泛的应用于兽医、畜牧、动物检疫、水产养殖等研究领域，成为分子生物学研究中一项重要的技术工具。在食品检测方面也都有了很大进展，包括致病菌检测、转基因食品检验、食品掺假检测等。

1 实时荧光定量PCR技术概述

1.1 实时荧光定量PCR技术基本原理

PCR(polymerase chain reaction)反应技术即为聚合酶链式反应，是模拟体内DNA复制的原理在体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescent quantitative PCR，RTQ-PCR)是在此基础上发展起来的实时定量方法，它是1996年由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)发明的，Heid等第一个发展了该方法，使用Taqman探针以FAM和TAMRA分别作为荧光报告染料和淬灭基团［1］。RTQ-PCR技术实现了PCR技术从定性到定量的突破，并且具有很多传统PCR技术所没有的优点，能够应用于基因的定量检测，病原体的检测，肿瘤基因检测，基因的表达、突变及多态性分析等多种科学研究领域［2］。

PCR反应由高温变性、低温退火(复性)和适温延伸等几步反应组成一个周期循环，当一个循环完成，DNA总量增加一倍，若反应重复进行，每次循环所得的产物都是下一次循环的模板，从而使模板DNA的拷贝数呈指数(2n)快速增加［3］。RTQ-PCR不仅是对模板DNA进行指数性扩增，而且通过检测每次循环PCR产物的总累积量，得到很好的定量结果。RTQ-PCR是在反应体系中加入荧光标记因子，随着DNA的复制扩增，荧光信号不断增强，当仪器检测到荧光信号强度达到设定的荧光阈值时，记录下此时的循环数(即CT值)，同时仪器自动绘制出扩增曲线和熔解曲线。利用一系列的数学方法对得到的数据信息进行处理分析，达到实时定量检测DNA片段的目的［4］。

1.2 实时荧光定量PCR技术分类

根据实时荧光定量PCR所用的荧光模式不同，RTQ-PCR方法分为荧光染料法和荧光探针法2种。

1.2.1 荧光染料法

荧光染料法是在PCR体系中加入荧光染料，荧光染料能非特异性的结合到DNA双链的小沟中，通过荧光信号的积累监测反应进行，从而对目的基因进行定量［5］。SYBR Green1是应用最广泛的一种荧光染料，仅能与DNA双链结合，结合到DNA双链上的SYBR染料能够发射荧光信号，而没有结合的不会发射，从而保证了荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步［6］。SYBR Green1法因成本低廉，被普遍应用于各种分子生物学实验研究。此外还有LC Green TM1和Pico Green等新型荧光染料，与SYBR Green1相比，LC Green TM1能够与dsDNA分子完全结合，高浓度下不会抑制PCR反应，而且其抗水解、抗热解和抗光解能力均比 SYBR Green1要强［6］。Pico Green比SYBR Green1的灵敏度较高，具有RNA、ssDNA以及其他物质影响小和线性范围广等优点［7］。荧光染料法的主要优势在于成本低，检测方法简单快捷，通用性好，不需要设计探针，能够高通量的定量PCR检测。但它不能识别特定的DNA模板，很容易受到引物二聚体和非特异性扩增产物的影响，所以想要得到好的定量结果，对PCR引物的特异性和PCR反应的条件要求较高。

1.2.2 荧光探针法

荧光探针法是利用能与目的DNA片段特异性杂交的探针，对PCR扩增产物进行定量指示，由于其特异性高，主要用于专一序列的DNA检测。其优点是高适应性和可靠性，重复试验结果高度稳定，但当目的基因序列较短时，实验效果不好［8］。根据荧光基团标记和共振能量转移的方式，主要分为水解探针和杂交探针，典型的水解探针有 TaqManTM探针和TaqMan MGB探针，杂交探针有双杂交探针、分子信标和荧光标记引物/探针等［9］。

最常用的水解型探针是TaqManTM探针，它是一种特异性的寡核苷酸探针，两端分别标记显色荧光基团和淬灭荧光基团。当探针完整时，显色荧光基团发射的荧光被淬灭荧光基团吸收，随着PCR反应的扩增，Taq酶的5，端外切酶活性把探针降解，使得显色基团与淬灭基团分离发出荧光信号。每扩增1条DNA链，即可形成1个荧光信号［8］。TaqMan MGB探针是根据TaqMan探针的不足改进起来的，它是将MGB(minor groove binder)分子加在探针的3’端，结合在双链DNA的小沟部分，采用的是非荧光淬灭基团。与TaqMan探针相比，TaqMan MGB探针更容易配对，分辨率大大提高(可以分辨出一个碱基的差异)［10］，具有荧光本底低、淬灭效果好、标记更灵活、荧光信号信噪比提高等明显优势。

双杂交探针是以荧光能量共振转移(FRET)技术为基础，所以又称为FRET探针或Light Cycler探针。它由2条探针组成，一条在5’端标记受体荧光基团，另一条在3’端标记供体荧光基团。在PCR反应过程中，2条探针首尾相连与同一模板链的相邻序列杂交结合，供受体基团产生FRET现象发出荧光信号。在PCR延伸阶段，2条探针在Taq聚合酶作用下分开，荧光消失，所以双杂交探针法检测的不是累积信号，而是实时信号［11－12］。分子信标法是利用一种发卡结构式的单链DNA作为探针，在自由状态下3’端的荧光报告基团和5’端的淬灭基团相互靠近，荧光被淬灭。在PCR反应过程中，与扩增产物杂交结合的发卡结构被逐渐拉开，2个末端分离，报告基团发出荧光［13］。分子信标的特点是能够循环使用，敏感度高，可识别出单核苷酸差异的序列，对检测点突变有很好的效果。

2 实时荧光定量PCR技术应用

到目前为止，通过PCR反应对核酸进行扩增是食品检测中最常用的方法［14］。实时荧光定量PCR技术以其特有的优点，已经广泛的应用于食品和农畜产品的各个研究领域，包括对mRNA表达分析，食源性致病菌、转基因食品、菌种分离以及各种食品中动物源性检测等［12］。

2.1 食源性致病菌检测

当今食品安全越来越受到人们的关注，这已经成为一个全球性的问题，其中由食品致病菌引发的一系列食源性疾病是最重要的原因之一。传统的致病菌检测方法存在很多弊端已经不能满足现今的食品安全检测要求，RTQ-PCR技术的应用为致病菌的快速准确检测提供了一个很好的技术方法。

沙门氏菌是食品中最重要的食源性致病菌之一，资料显示，无论是在我国还是在全球范围内的致病菌食物中毒中沙门氏菌所占比例都非常大，对人和动物产生极大的危害，导致食物中毒、伤害和肠胃炎等多种人类疾病［15］。杜雄伟［16］等对inva基因设计引物，利用荧光染料法建立了沙门氏菌RTQ-PCR检测方法，对沙门氏菌的检测下线到达101CFU/mL，具有很高的灵敏度，能够快速、准确的检测肉制品的沙门氏菌，而且操作简单，耗时短。Rodriguez［17］等利用实时荧光定量PCR法来比较检测生猪肉和禽肉、生菜沙拉以及绵羊奶制品中的沙门氏菌，结果表明该方法快捷高效，检出范围广，符合ISO标准，实用性很强。

金黄色葡萄球菌是引发食物中毒的另一种常见致病菌，存在于乳、肉、蔬菜等食物中，能够产生肠毒素等多种毒素，引起人体产生严重感染［18］。Pilla［19］等人建立的双向实时定量PCR方法来鉴定金黄色葡萄球菌，通过对从90头乳房炎奶牛中分离的140株菌进行测试，以nuc和Sa442基因为目的基因，结合形态学和生物化学特征，最后通过基因测序比对，结果显示该方法敏感性和特异性达到了100%，而且可用于高通量鉴定。又通过对40个牛奶样品的检测，表明此方法能直接对牛奶样品进行乳房炎乳的鉴定。此外，实时荧光定量PCR技术还用于副溶血性弧菌、志贺氏菌、大肠杆菌、单增李斯特菌等致病菌的检测，并得到了很好的应用［20－21］。

2.2 转基因食品检测

随着大量的转基因食品进入市场，对转基因食品的标识、安全性等问题越来越受到关注，传统的检测方法中存在敏感性差、操作繁琐、假阳性等很多缺点，建立准确、快速、灵敏的鉴定方法已经成为当今研究的热门课题。实时荧光定量PCR技术作为一种新兴技术在分子水平上检测转基因成分准确性更高，被广泛应用于转基因成分的定性、品系鉴定和含量检测［22］。曹际娟［23］等利用转基因小麦外源片段与染色体重组的边界序列设计引物，建立实时荧光PCR反应体系来检测转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系，并用转基因玉米、大豆、稻米和非转基因小麦作对照。这种方法的品系鉴定特异性很好，灵敏度可达到0.01%(m/m)，为检测含有相同外源基因的不同转基因小麦品系提供了更为有效的方法，具有较大的应用价值。

2.3 食品中动植物源性检测

近年来市场上出现了大量食品掺假、掺杂的违法现象，由于受到价格、加工原料、成本等诸多因素的影响，一些不法生产商使用成本较低的材料来冒充生产食品，以此获取高额利润。实时荧光定量PCR法在检测食品中的掺杂成分方面被国内外研究者广泛应用于实践生产和实验研究中，建立了食品中动植物源性多成分的实时荧光定量PCR检测法［24－26］。传统的检测方法多建立在对物种蛋白质的分析上，通过免疫学技术确定某种源性成分［27］。而鉴定DNA分子除了具有种内保守性高、种间特异性强的特点外还有稳定性较高的优点，可单独作为物种判别依据［28］。

史艳宇［29］等利用鸭线粒体基因全序列作为靶位点设计探针和引物，以牛肉、羊肉、鸡肉、猪肉等畜禽肉制品作为参考物种做特异性检测，用羊肉DNA(50 mg/kg)溶液对鸭肉DNA稀释进行灵敏度实验，成功建立检测鸭源性成分实时荧光定量PCR方法。结果显示，该方法设计的引物和探针特异性强，能快速有效检测鸭源性成分，且羊肉成分存在对鸭肉的灵敏度无影响，灵敏度达到0.1 μg/kg的较高水平。通过对市售加工肉制品中的鸭源性成分检测，结果检测出加工肉制品中的鸭源性成分，这种方法应用范围广，为食品的掺假制假检测提供了良好的技术支持。实时荧光定量PCR技术也应用于食品中香蕉成分的检测，李富威［30］等根据香蕉叶绿体rbcL基因序列的高度保守区域设计引物和探针对香蕉和55种对照样品进行特异性检验，灵敏度为香蕉DNA 0.000 1 ng/μL，香蕉粉0.001%(m/m)。此外，李楠［31］等人和范丽丽［32］等人还分别实现了肉制品中马源性成分和猪源性成分检测的实时荧光定量PCR检测方法。

2.4 mRNA表达量的研究应用

研究mRNA的表达是实时荧光定量PCR技术一项非常重要的应用［33］。大部分组织细胞都是先将细胞核内的DNA转录成mRNA，然后通过核糖体指导合成相应的蛋白质，观察组织细胞中相应mRNA的表达量是研究组织蛋白的关键，实时荧光定量PCR具有准确、快速、灵敏等优点，能够在研究中准确分析基因mRNA的表达水平。

国内外关于利用荧光定量PCR技术研究mRNA表达的报道有很多，其主要实验步骤为:先提取样品中的总RNA并反转录成cDNA，然后用设计好的引物对cDNA进行荧光定量PCR扩增，并对总RNA和PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，接着将扩增产物纯化回收后克隆测序比对，并以倍数梯度稀释cDNA制作扩增效率曲线，最后分析数据和讨论实验结果。黄雅娟［34］等在文章中详细说明了建立绵羊嫩度相关基因mRNA表达量的荧光定量PCR的检测方法。Fan［35］等研究了MYF-6基因在杜洛克猪和皮特兰猪出生后骨骼肌中的表达规律，使用SYBR荧光染料进行相对表达量分析，发现在腰眼肌中皮特兰猪MYF-6基因的表达量高于杜洛克猪，具有重要的意义。李剑虹［36］等使用荧光定量PCR方法研究了AA鸡肉PCK1基因的表达量与冷刺激时间的关系，选用相对定量法处理数据，详细探讨了随着冷刺激处理时间的不同，PCK1基因在AA肉鸡肝脏、肾脏、肺脏、脾脏和胸腺等不同组织部位的表达变化及原因。

3 实时荧光定量PCR技术展望

虽然实时荧光定量PCR技术有许多优点，但也存在不足之处，如实验设备要求高，试剂材料价格昂贵，不能实时检验出PCR产物的大小，实验数据处理方法繁琐等。随着技术的发展，RTQ-PCR技术也会不断得到改进和完善，尤其是与基因芯片、高通量测序等其他生物技术相结合，其诸多优点会显示出更强大的优势，被越来越多的科学研究者接受。在未来的发展趋势中，实时荧光定量PCR技术在食品质量控制领域会是一种非常好的工具，在食品安全检测的很多方面也会成为一种新的检测标准。

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