棉籽壳酶法制备低聚木糖工艺条件优化

丁长河，张洪宾，周迎春，马 康，殷丽君

（河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州 450001）

棉籽壳酶法制备低聚木糖工艺条件优化

丁长河，张洪宾，周迎春，马 康，殷丽君

（河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州 450001）

对棉籽壳酶法生产低聚木糖的工艺参数进行优化。采用响应面法优化了预处理时间、盐酸溶液质量分数和酶解pH值，得到最佳工艺条件为：预处理时间35.70 min、盐酸溶液质量分数0.17%、酶解pH 6.5。在此条件下，木二糖质量浓度达到14.52 g/L，与模型预测值基本相符。且低聚木糖以木二糖为主，木二糖得率为8.13%（以棉籽壳干质量计）。

棉籽壳；低聚木糖；木二糖；响应面法

低聚木糖（xylo-oligosaccharide，XO）是由2～7 个木糖以β-1,4糖苷键结合而成的一种功能性寡聚糖[1]，固态低聚木糖为乳白色至淡黄色粉末，主要是从富含木聚糖的植物（如棉籽壳、麸皮、玉米芯等）中，通过木聚糖酶酶解而制得的一种非消化低聚糖[2-4]。低聚木糖的主要有效成分是木二糖和木三糖，其中木二糖的甜度约为蔗糖的40%，含量达到50%的低聚木糖产品的甜度约为蔗糖的30%，甜味纯正，类似蔗糖。低聚木糖作为一种理想的功能性食品添加剂，它不能够被消化道内的消化酶水解，且代谢不依赖胰岛素，不影响人体血糖，属于无热量甜味剂，可以满足糖尿病人群对糖的需求被广泛用于糖尿病人食品中。除此之外低聚木糖还常被用于减肥、预防癌症、补钙等各类保健食品中[5-6]。低聚木糖极强的酸热稳定性、较好耐储藏性以及与砂糖相似能够很好增强饮料醇厚口感的特点[7]，可部分取代砂糖且不用担心因加入低聚木糖而对饮料中其他成分带来影响。

动物食用添加低聚木糖的饲料后能明显提高动物对营养物质的吸收利用率、促进动物生长、改善动物肠道环境、增强机体免疫力[8-12]。有研究[13]将低聚木糖用于血液透析患者高血脂并发症的治疗，取得了良好的效果，同时低聚木糖对肠道内双歧杆菌等有益菌的增殖也有良好的效果，因此在医药中低聚木糖具有很大的发展潜力[14]。

我国是世界棉花生产大国，2013年棉花产量预计达到640万 t左右，棉籽壳资源丰富。但从我国目前棉籽壳的利用情况来看，棉籽壳大部分用作食用菌栽培的原料，利用途径比较单一，生物利用率极低。因此，寻找棉籽壳新的利用途径及提高棉籽壳加工附加值具有很重要的意义。根据文献[15-18]可知，目前酶法制备低聚木糖主要有碱-酶法、酸-酶法、蒸汽爆喷-酶法、微波辅助-酶法等。但利用以上方法制备的水解产物中，具有功能特性的木二糖所占比例较少（30%左右）[19]。与前人研究相比，本研究利用棉籽壳制备低聚木糖主要有以下优势：所用原料棉籽壳中的木聚糖长链不含阿拉伯糖等杂糖，有利于制得纯度较高的低聚木糖溶液；实验条件温和，降低了工厂生产的设备要求，利于工业化生产；酶解产物中具有功能特性的木二糖所占比例（90%以上）较大，减少了后期纯化的成本，利于生产出高纯度的低聚木糖产品。本实验室前期研究已确定，预处理条件一定，酶解温度50 ℃、酶解时间20 h时酶解效果最好。本实验设计了预处理时盐酸溶液质量分数、预处理时间、木聚糖酶种类、酶解pH值对木二糖得率的影响。在单因素试验的基础上，采用响应面法优化提取工艺参数，确定利用棉籽壳生产低聚木糖的最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

棉籽壳 新疆博乐油脂股份有限公司；D-木糖（分析纯） 上海迈坤化工有限公司；木聚糖酶分别购自山东省沂水隆大生物工程有限责任公司（记为QS酶）、诺维信（中国）生物技术有限公司（记为WX酶）、宁夏和氏璧生物技术有限公司（记为NX酶）、山东戴迪实业发展有限公司（记为SD酶）、苏柯汉生物工程有限公司（记为SK酶）。

1.2 仪器与设备

pH211 pH计 哈纳仪器公司；MVE-1漩涡混合器北京金北德工贸有限公司；10 μL微量进样器 上海安亭微量进样器厂；THZ-82 B气浴恒温振荡器 江苏省金坛市医疗仪器厂；UV-7504紫外-可见分光光度计 上海欣茂仪器有限公司；高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪、示差折光检测器美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 提取液及酶解液中糖组分的测定

采用薄层层析（thin layer chromatography，TLC）法[20]。选择乙腈和水85∶15（V/V）为展开剂，选用5%（V/V）的硫酸甲醇溶液为显色剂。样品上样量为2.0～4.0 μL，展开时，薄层层析板没入展开剂5 mm左右，两次展开。显色剂润湿后置于130 ℃烘箱中烘5 min。

1.3.2 还原糖含量的测定

采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[21]。

1.3.3 木聚糖（可溶性戊聚糖）含量的测定

采用地衣酚-盐酸法[22]。

1.3.4 样品中主要成分的测定

根据QB/T 2984—2008《低聚木糖》，将待测样品稀释至合适梯度经0.45 μm膜过滤，用HPLC检测。色谱条件为：色谱柱：Shodex sugar KS-802，内径8 mm，柱长30 mm，填料粒度6 μm离子型凝胶柱；检测器：示差折光检测器；流动相：超纯水。在测定的前1 d接通示差折光检测器电源，预热稳定（45 ℃），安装色谱柱，调柱温至80 ℃，以0.1 mL/min的流速通入流动相平衡过夜。在正式进样分析前，在所有流动相输入参比池20 min以上，再回复正常流速使流动相经过样品池，调节流速0.8 mL/min走基线，待基线走稳后即可进样，进样量为20 μL。

1.3.5 单因素试验

1.3.5.1 预处理盐酸溶液质量分数对得率的影响

秤取4 份10 g棉籽壳分别加入10 mL质量分数0.1%、0.2%、0.3%、0.4%盐酸溶液，在60 ℃条件下水浴30 min，测定提取液中还原糖转化率及可溶性戊聚糖的得率。得率计算公式如下：

式中：W为得率/%；C为酶解液中还原糖或可溶性戊聚糖含量/（g/L）；V为酶解液体积/L；M为棉籽壳干质量/g。

1.3.5.2 预处理时间对得率的影响

秤取6 份10 g棉籽壳分别加入10 mL 0.2%盐酸溶液，在60 ℃条件下分别水浴20、30、40、50、60、70 min，测定提取液中还原糖得率及可溶性戊聚糖得率。

1.3.5.3 不同种类酶对得率的影响

取6 份10 g棉籽壳分别加入10 mL 0.2%盐酸溶液，在60 ℃条件下水浴40 min。预处理后取其中一份样品作为对照样，调节其他样品pH值至6.0，再分别加入0.01%（棉籽壳干质量）不同种类的木聚糖酶，50 ℃气浴振荡20 h。分别测定各样品还原糖得率及可溶性戊聚糖得率。

1.3.6 最适酶解pH值的确定

配制一系列pH 3.5～9.5的200 mmol/L缓冲溶液，所用的缓冲体系和pH值范围为：柠檬酸-柠檬酸钠（pH 3.5、4.0、4.5、5.0），MES（pH 5.5、6.0、6.5、7.0），Tris-HCl（pH 7.5、8.0、8.5），glycine-NaOH（pH 9.0、9.5）。分别用以上缓冲液以体积比1∶3与去离子水溶解的木聚糖（1.3%）混合作为反应底物，取1.8 mL底物加0.2 mL用相应50 mmol/L缓冲液稀释过的木聚糖酶在60 ℃水浴条件下，反应10 min。取1 mL反应过的酶解液加入1 mL DNS溶液沸水浴15 min，迅速加1 mL质量分数40%酒石酸钾钠冷却15 min，540 nm波长处测吸光度。测定纯酶的木聚糖酶活力[23]，以最大值为100%。

1.3.7 响应面法优化提取条件

在单因素试验的基础上，选取3 个主要影响因子：预处理时间（A）、盐酸溶液质量分数（B）、酶解pH值（C），运用Box-Behnken试验设计原理，以木二糖质量浓度（Y）为指标进行响应面试验设计，优化提取工艺条件，响应面设计因素与水平如表1所示。

1.4 模型验证

以响应面分析法优化出的工艺条件提取棉籽壳中的木二糖，通过比较理论值和验证实验值来证明其有效性。

2 结果与分析

2.1 预处理盐酸溶液质量分数对得率的影响

由图1、2可知，随着盐酸溶液质量分数的增加，还原糖得率和可溶性戊聚糖得率都呈递增趋势，与TLC板比较得出，在盐酸溶液质量分数为0.3%和0.4%时单糖较多，因此选取盐酸溶液质量分数范围为0.1%～0.2%。

2.2 预处理时间对得率的影响

由图3、4可知，随着预处理时间的延长，还原糖得率和可溶性戊聚糖得率在40～60 min变化不明显，结合TLC板结果可知，预处理时间50～70 min时单糖含量较高；20 min时可溶性戊聚糖得率最低。因此选定预处理时间为30～40 min。

2.3 酶种类对得率的影响

由图5、6可以看出，与酶解前样相比较，还原糖得率变化不明显，其中NX酶酶解后样与SK酶解后样可溶性戊聚糖得率较高。比较TLC结果可知，在相同进样量的条件下NX酶解后样中木二糖质量浓度大于SK酶酶解后样中木二糖质量浓度，因此选定NX酶为实验用酶。

2.4 酶解pH值对酶活的影响

由图7可知，在pH 3.5～9.5范围内木聚糖酶活变化比较明显，随着酶解pH值的不断增加，酶活呈现了先增、再缓、后减的趋势。pH 5.5时酶活最大。在pH 4.5～6.5范围内酶活较大，因此，选定范围为pH 4.5～6.5。

2.5 回归方程的建立与分析

在单因素试验的基础上，利用响应面法选择最佳提取工艺，试验设计方案及结果见表2。采用Design-Expert 8.05b软件对所得数据进行多元回归拟合，得到二次多项回归模型为：Y=13.82+0.36A—0.54B+1.52C—1.00AB+ 0.48AC+1.91BC—1.74A2—1.64B2—1.12C2。

对模型进行回归方程系数显著性分析见表3。模型中一次项B、C，二次项AB、BC、A2、B2、C2（P＜0.01）影响极显著。响应面回归模型（P＜0.01）达到极显著水平，失拟项不显著（P＞0.05），说明该二次模型能够拟合真实的试验结果。可见，各试验因素对酶解液中木二糖质量浓度的影响不是简单的线性关系。各因素之间交互作用对木二糖质量浓度影响的响应面如图8～10所示。为了分析酶解液中的主要成分，从TLC分析中（图11）可以得出酶解液以木二糖为主，从HPLC分析结果中得出木二糖、木三糖、木四糖占总糖比之和为71%，其中木二糖占总糖的64.5%，木三糖占其总量的6.46%。因此响应面的最佳结果以木二糖质量浓度来衡量。由Design-Expert软件分析得到响应面值最大时对应的最佳条件是预处理时间35.70 min、盐酸溶液质量分数0.17%、酶解pH 6.5，木二糖质量浓度理论值为14.53 g/L。

为了验证响应面法的可行性，选择预处理时间35.70 min、盐酸溶液质量分数0.17%、酶解pH 6.5，进行验证实验，3 次平行实验得到木二糖质量浓度平均值为14.52 g/L，与理论值基本相符，酶解后木二糖得率为8.13%（以棉籽壳干质量计）。因此，响应面法对棉籽壳制备低聚木糖的条件优化是可行的，具有实际应用的价值。

3 3 结 论

本实验重点研究了预处理时间、盐酸溶液质量分数、酶解pH值对木二糖质量浓度的影响，采用Box-Behnken试验设计对利用棉籽壳提取低聚木糖的工艺条件进行了优化。得出最佳的提取工艺条件为：预处理时间35.70 min、盐酸溶液质量分数0.17%、酶解pH 6.5。进行验证实验，3 次平行实验得到木二糖质量浓度平均值为14.52 g/L，理论值为14.53 g/L，重复性实验结果较好。酶解后木二糖得率为8.13%（以棉籽壳干质量计），为进一步的实验研究奠定了基础。

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Optimization of Extraction Conditions for Xylo-oligosaccharides from Cotton Seed Husk

DING Changhe, ZHANG Hongbin, ZHOU Yingchun, MA Kang, YIN Lijun
(College of Food Science and Technology, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China)

The enzymatic hydrolysis of cotton seed husk with xylanase for xylo-oligosaccharides production was optimized by response surface methodology in this research. A pretreatment time of 35.70 min with 0.17% HCl was found optimal for the enzymatic hydrolysis, which was performed at an initial pH of 6.5. At the end of the hydrolysis, the concentration of xylobiose in hydrolysis was measured to be 14.52 g/L, agreeing with the predicted value. The final product was mostly xylobiose with a yield of 8.13% (relative to the dry weight of cotton seed husk).

cottonseed husk; xylo-oligosaccharides; xylobiose; response surface methodology

TS245.9

A

1002-6630（2015）04-0029-05

10.7506/spkx1002-6630-201504006

2013-11-25

河南省科技成果转化基金项目（132201610014）；河南工业大学研究生教育创新计划基金项目（2012YJCX22）

丁长河（1968—），男，副教授，博士，研究方向为农产品加工和功能性低聚糖。E-mail：dch2004-2008@163.com