河南、山西连翘叶黄酮类和三萜酸类化合物含量比较

原江锋，赵君峰，孙军杰，何灵美，张志琪，刘 贺

(1.河南科技大学食品与生物工程学院,河南 洛阳 471003；2.山西芳灵贸易有限责任公司,山西 太原 030045；3.陕西师范大学化学化工学院,陕西 西安 710062)

河南、山西连翘叶黄酮类和三萜酸类化合物含量比较

原江锋1，赵君峰1，孙军杰1，何灵美2，张志琪3，刘 贺1

(1.河南科技大学食品与生物工程学院,河南 洛阳 471003；2.山西芳灵贸易有限责任公司,山西 太原 030045；3.陕西师范大学化学化工学院,陕西 西安 710062)

为进一步对连翘叶中黄酮类化合物和三萜酸类主要活性成分含量进行分析,分别采用分光光度法和高效液相色谱法测定河南、山西连翘叶中总黄酮、芦丁、金丝桃苷、槲皮素、总三萜酸、齐墩果酸、熊果酸含量。结果表明：河南连翘叶中总黄酮、芦丁、金丝桃苷含量和槲皮素含量高于山西连翘叶中的含量,而山西连翘叶中总三萜酸、齐墩果酸含量和熊果酸含量高于河南连翘叶中的含量。连翘叶中黄酮类和三萜酸类的含量较高,结果为综合利用连翘叶资源提供参考依据。

连翘叶；芦丁；金丝桃苷；槲皮素；齐墩果酸；熊果酸

连翘叶为木犀科（Oleacaae）植物连翘（Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl）的干燥叶[1]，传统主要以野生果实入药。《中药大辞典》《中华本草》等现代典籍记载“连翘茎叶，味苦、性寒，功能主治清热解毒，主治心肺积热”[2]。我国50%的连翘资源靠山西供给[3]，30%的连翘资源靠河南供给[4]，民间常用连翘嫩叶作为保健茶饮用[5]。

现代研究表明，连翘叶中含有苯乙醇苷类、木脂素类、黄酮类、三萜类等化学成分，与连翘果实十分类似，连翘叶还具有降血糖、保肝、抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤等作用[6-10]。药理研究表明，连翘叶中总黄酮提取物具有良好的抗氧化和抗疲劳等生物活性[11]。齐墩果酸和熊果酸为五环三萜类化合物，熊果酸具有抑制血管生成、抗肿瘤、抗炎、抑菌、抗HIV药理作用；齐墩果酸具有保肝、消炎、降糖、抗HIV和抗肿瘤药理作用[12]。根据已有文献报道，河北省、陕西省[13-14]的连翘叶中总黄酮和芦丁及河北省[15]连翘叶中齐墩果酸和熊果酸含量已明确，但是对于主产区山西和河南两地的连翘叶黄酮类化合物和三萜酸类化合物的研究却无人报道。本实验对山西和河南两地连翘叶中总黄酮和总三萜酸含量的进行测定，并且进一步对连翘叶中黄酮类化合物和三萜酸类主要活性成分进行含量分析，为连翘叶作为新资源的深入开发提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

连翘叶，2012年9月采自河南豫西伏牛山地区和山西左权县连翘种植基地，经河南科技大学农学院候小改教授鉴定为木犀科植物连翘（Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl）的干燥叶。

甲醇、乙腈（均为色谱纯） 美国Fisher公司；芦丁（批号100080-200707，纯度＞92.5%）、金丝桃苷（批号111521-201205，纯度＞93.3%）、槲皮素（批号100081-200907，纯度＞96.5%）、齐墩果酸（批号110709-201206，纯度＞94.9%）、熊果酸（批号110742-201220，纯度＞99.3%） 中国食品药品检定研究院；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

1260高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；BS 124S型万分之一天平 赛多利斯科学仪器有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 连翘叶中总黄酮含量的测定

1.3.1.1 芦丁标准曲线的绘制

精密称取芦丁标准品4.0 mg，用体积分数80%乙醇溶解，定容至10 mL，得质量浓度0.40 mg/mL的芦丁标准液。吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL标准液分别置于试管中，分别加入质量分数为5% NaNO21.0 mL，质量分数10% Al(NO3)31.0 mL，质量分数40% NaOH 1.0 mL，用体积分数80%乙醇定容至10 mL，放置15 min。以上述溶剂为空白，分别在510 nm波长处测定吸光度（A510nm），以A510nm为纵坐标，以所加的标准品质量浓度为横坐标，并求出线性回归方程，建立标准曲线。

1.3.1.2 样品溶液的制备及连翘叶中总黄酮的测定

分别精密称取河南和山西连翘叶1.0 g，加入体积分数80%乙醇溶液20 mL，45 ℃超声提取1.0 h，间歇搅拌，提取2 次，合并提取液后滤过，吸取样品溶液0.3 mL，置于试管中，按照1.3.1.1节方法，从标准曲线上计算溶液中总黄酮的含量。

1.3.2 连翘叶中总三萜酸含量的测定

1.3.2.1 齐墩果酸标准曲线的绘制

精密称取齐墩果酸5.0 mg，用无水乙醇溶解，定容至5 mL，得质量浓度1.0 mg/mL的齐墩果酸标准液。吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL标准液置于试管中，水浴挥干乙醇，加质量分数5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL，高氯酸1.0 mL，密封混匀后，于60 ℃水浴条件下显色45 min，冰浴冷却，加冰醋酸定容至5.0 mL。以上述溶剂为空白，在550 nm波长处测定吸光度A，以A为纵坐标，以所加的标准品质量浓度为横坐标，并求出线性回归方程，建立标准曲线。

1.3.2.2 样品溶液的制备及连翘叶中总三萜酸的测定

分别精密称取河南、山西连翘叶10.0 g，加入甲醇50 mL，超声处理（250 W、40 kHz）40 min，放冷，再称定，用甲醇补足失质量，得样品溶液。吸取样品溶液0.3 mL，按照1.3.2.1节方法，从标准曲线上计算连翘叶中总三萜酸的含量。

1.3.3 色谱条件及检测

色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；黄酮类化合物流动相:乙腈-甲醇-质量分数0.3%磷酸溶液梯度洗脱:0～15 min（5∶0∶95～15∶0∶85，V/V），15～25 min（15∶0∶85～15∶5∶80，V/V），25～40 min（15∶5∶80～75∶15∶10，V/V），40～50 min（75∶15∶10～85∶10∶5，V/V）；流速1.0 mL/min；检测波长360 nm；三萜酸类化合物流动相:甲醇-质量分数1%磷酸溶液（85∶15，V/V）；流速0.6 mL/min；检测波长210 nm。

1.3.4 混合对照品溶液的制备

精密称取50 ℃减压干燥至恒质量的芦丁、金丝桃苷、槲皮素对照品分别为2.6、2.2、1.2 mg，用甲醇溶解后定容于20 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得芦丁、金丝桃苷和槲皮素质量浓度分别为0.13、0.11、0.06 mg/mL的混合对照品溶液Ⅰ；精密称取50 ℃定容、干燥至恒质量的齐墩果酸和熊果酸对照品分别为3.5、3.2 mg，用甲醇溶解后定容于10 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得齐墩果酸和熊果酸质量浓度分别为0.35 mg/mL和0.32 mg/mL的混合对照品溶液Ⅱ。

1.3.5 样品溶液的制备

1.3.5.1 黄酮类化合物供试品溶液制备

分别取自然晾干后的河南、山西连翘叶，粉碎，各精密称取0.650 g置于25 mL锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超声处理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再称定，用甲醇补足失质量，摇匀，滤过，经0.45 μm滤膜滤过，滤液作为测定黄酮类化合物供试品溶液Ⅲ。

1.3.5.2 三萜酸类化合物供试品溶液制备

分别取自然晾干后的河南和山西连翘叶，粉碎，各精密称取10.0 g置于100 mL锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，超声处理（250 W、40 kHz）40 min，放冷，用甲醇补足失质量，摇匀、滤过、经0.45 μm滤膜滤过，滤液作为测定三萜酸类化合物供试品溶液Ⅳ。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

以芦丁为标准品，其回归方程为y=4.632x+0.034 7、r=0.998 2、n=6。由此可知，芦丁对照品在0.04～0.20 mg范围内线性良好。以齐墩果酸为标准品，其回归方程为y=0.983x+0.076 9、r=0.999 7、n=6。由此可知，齐墩果酸对照品在0.20～1.00 mg范围内线性良好。

2.2 线性范围考察

分别进混合对照品溶液Ⅰ0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、3.0、4.0 μL，分别进混合对照品溶液Ⅱ0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μL，注入高效液相色谱仪中，进行测定。以芦丁、金丝桃苷、槲皮素、齐墩果酸、熊果酸的进样量为横坐标（X），以各对应的峰面积为纵坐标（Y），计算方程见表1，对照品与样品的色谱图见图1、2。

2.3 检出限

检出限是指从背景干扰中区分出被检测物的最低质量浓度，即信噪比为3左右时的样品质量浓度，5 个被测样品的检出限见表1。

2.4 精密度实验

分别吸取混合对照品溶液Ⅰ和溶液Ⅱ，连续进样6 次，测定峰面积，经计算芦丁、金丝桃苷、槲皮素、齐墩果酸、熊果酸峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为1.9%、1.3%、1.9%、2.4%、2.7%表明仪器精密度良好。

2.5 重复性实验

精密吸取供试品溶液Ⅰ和溶液Ⅱ2.0 μL，按1.3.3节色谱条件分别重复进样6 次，记录相应保留时间的峰面积。结果表明，芦丁、金丝桃苷、槲皮素、齐墩果酸、熊果酸含量的RSD分别为1.5%、1.7%、1.5%、2.5%、2.7%（n=6），表明此方法重复性良好。

2.6 稳定性实验

取室温密闭放置的供试品溶液Ⅰ和溶液Ⅱ，分别在0、1、2、5、10 h进样2.0 μL，记录相应保留时间的峰面积，结果芦丁、金丝桃苷、槲皮素、齐墩果酸、熊果酸峰面积的RSD分别为2.4%、2.4%、2.3%、2.6%、2.8%（n=6），表明供试品溶液中5 个成分在10 h内基本稳定。

2.7 回收率实验

采用加样回收率实验方法，精密称取已知含量的河南伏牛山同一连翘叶样品0.5 g，平行6 份，精密加入一定量的混合对照品溶液，分别按1.3.5.1节和1.3.5.2节方法，进行超声提取，过滤，注入高效液相色谱仪测定，计算回收率。芦丁、金丝桃苷、槲皮素、齐墩果酸、熊果酸的回收率分别为98.0%、98.9%、96.5%、98.7%、97.2%，RSD分别为2.1%、1.1%、2.8%、2.2%、2.1%（n=6）符合分析要求。

2.8 样品中化合物测定

2.8.1 总黄酮、芦丁、金丝桃苷、槲皮素的测定

按照1.3.1.2节测得河南、山西连翘叶总黄酮类化合物分别为24.48 mg/g和13.41 mg/g。在1.3.3节色谱条件下进样分析，测定峰面积，用外标法计算出芦丁、金丝桃苷和槲皮素的含量，测定结果见表2。河南连翘叶中总黄酮含量高于山西连翘叶中总黄酮含量；河南连翘叶中金丝桃苷、芦丁和槲皮素的含量高于山西连翘叶中的含量；芦丁和金丝桃苷的含量要远高于槲皮素的含量。

2.8.2 样品中总三萜酸、齐墩果酸、熊果酸的测定

按照1.3.2.2节测得河南、山西连翘叶总三萜酸化合物分别为20.12 mg/g和26.47 mg/g。在1.3.3节色谱条件下进样分析，测定峰面积，用外标法计算出齐墩果酸、熊果酸的含量，测定结果见表3。山西连翘叶总三萜酸含量高于河南连翘叶总三萜酸含量；山西连翘叶中齐墩果酸和熊果酸含量是河南连翘叶中含量的2 倍左右；熊果酸含量要高于齐墩果酸含量。

3 讨 论

我国的连翘以野生为主,为国家3级药用保护植物,为大宗、常用中药材,果实为著名中药。随着中药产业的快速发展,市场对连翘的需求量越来越大。连翘以野生为主,资源成本低、质量好,占全国连翘供给量达到80%的山西和河南两地,连翘资源丰富。近年来,来源于植物中的天然产物的生物活性,具有不良反应小的优点,越来越受到人们的重视,本实验针对连翘叶中黄酮类化合物和三萜酸类化合物进行分析,为进一步对连翘叶资源的利用和开发提供理论依据。

黄酮类化合物是一类广泛存在于自然界、具有多种药理活性的天然多酚类化合物。大量研究表明,富含黄酮类化合物的银杏叶[16]、桑叶[17]、竹叶[18]等植物具有极强的保健价值,已经将这些原料开发成食品添加剂、食品保健品、天然药物、日用化妆品等产品。本实验研究结果标明：河南伏牛山连翘叶总黄酮、芦丁、金丝桃苷、槲皮素含量高于山西左权县连翘叶；河南连翘果实与河南、山西连翘叶中芦丁、金丝桃苷和槲皮素含量高低趋势类似,均是金丝桃苷＞芦丁＞槲皮素[19-20]；连翘叶总黄酮含量要高于桑叶[17]、竹叶[18]中总黄酮的含量。

三萜酸类化合物属于五环三萜类化合物,其中的齐墩果酸和熊果酸广泛存在于自然界中,具有多种显著的生物活性,应用前景广阔。根据本实验结果表明,山西左权县地区连翘叶三萜酸、齐墩果酸、熊果酸的含量高于河南伏牛山连翘叶；河南、山西连翘叶中熊果酸含量大于齐墩果酸含量,这与河北连翘叶报道[15]相一致,并且河南、山西连翘叶中的齐墩果酸和熊果酸含量要高于河北连翘叶；连翘叶中三萜酸含量要高于马桑叶[21]、暗罗叶[22]中三萜酸含量。

我国河南、山西两地连翘叶资源丰富，但由于连翘叶没有进入国家药典，因此连翘叶资源没有得到合理的开发和利用，造成了连翘叶资源白白的浪费。本实验表明连翘叶中富含黄酮类和三萜酸，因此利用连翘叶为原料制备以黄酮类和三萜酸类化合物为主的产品具有很好的开发价值；并且连翘叶中芦丁、金丝桃苷、齐墩果酸、熊果酸化合物的含量较高，因此对芦丁、金丝桃苷、齐墩果酸、熊果酸的提取、分离工艺有进一步进行深入研究的必要性。本项研究为进一步对连翘叶资源的利用和开发提供了重要参考信息。

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Determination of Flavonoids and Triterpene Acids in Forsythia suspensa Leaves from Henan and Shanxi Provinces

YUAN Jiangfeng1, ZHAO Junfeng1, SUN Junjie1, HE Lingmei2, ZHANG Zhiqi3, LIU He1
(1. College of Food and Bioengingeering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China; 2. Shanxi Fangling Tradeing Co. Ltd., Taiyuan 030045, China; 3. School of Chemistry and Chemical Engineering, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China)

The objective of this study was to determinate the contents of total flavonoids, rutin, hyperin, quercetin, total triterpene acids, oleanolic acid and ursolic acid in Forsythia suspensa leaves from Henan and Shanxi provinces by spectrophotometry and HPLC method, respectively. The contents of total flavonoids, rutin, hyperin and quercetin in F. suspensa leaves from Henan province were higher than in those from Shanxi province, but the contents of total triterpene acids, oleanolic acid and ursolic acid from Shanxi province were higher than those from Henan province. The results showed that the contents of fl avonoids and triterpene acids in F. suspensa leaves from both provinces were relatively high. This study provided important information for comprehensive utilization of F. suspense leaves.

Forsythia suspensa leaves; rutin; hyperin; quercetin; oleanolic acid; ursolic acid

Q946.91

A

10.7506/spkx1002-6630-201510033

2014-06-30

洛阳市科技攻关项目(1401076A)；国家自然科学基金面上项目(21275098)；本科生科研训练计划项目(2014113)

原江锋(1978—),女,副教授,博士,主要从事生物活性成分的分析和应用研究。E-mail：jiangfengyuan@163.com