一种简便的皮层神经元原代培养方法的建立及其培养结果分析

唐仕军，赵冬，朱立仓，李晓天，朱文学，杨鹏，王业忠

(1石河子大学医学院第一附属医院，新疆石河子832000；2石河子大学医学院)



一种简便的皮层神经元原代培养方法的建立及其培养结果分析

唐仕军1,2，赵冬1，朱立仓1，李晓天1,2，朱文学1,2，杨鹏1,2，王业忠1

(1石河子大学医学院第一附属医院，新疆石河子832000；2石河子大学医学院)

摘要：目的建立一种简便的皮层神经元原代培养方法，并鉴定其培养效果。方法取出生24 h内的SD大鼠大脑皮层组织，采用胰酶消化法获取神经元细胞悬液，用10% FBS+DMEM高糖培养基接种在经多聚赖氨酸包被的培养板中，4 h后全量换用Neurobasal+2% B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺培养液。培养后采用倒置相差显微镜观察神经元形态变化，连续观察8天。神经元培养7～8天进行免疫荧光染色，于激光共聚焦显微镜下对神经元进行鉴定，计算神经元密度和纯度。结果皮层神经元接种时体积小，透亮，呈圆形，单个散在分布。接种后有少量细胞开始贴壁，2 h左右贴壁较多，少量细胞伸出短小的突起；4 h左右已基本贴壁，大量细胞伸出突起，周围光晕明显；培养3天时神经元突起明显伸长，相互交织，细胞透亮，立体感强，呈圆形、椭圆形、梭形；培养5～6天时神经元体积增大，突起交织成网状；培养7～8天时，神经元细胞体饱满，细胞质透亮，细胞核大而明显，细胞体周围折光性强，立体感好，突起交织成致密的网络结构。经免疫荧光染色后鉴定，分离培养的是神经元，密度1.5×106个/mL，纯度>90%。结论成功建立了一种操作简便的皮层神经元培养方法，该方法培养的神经元纯度高、密度大，可为今后的相关学科研究提供良好的细胞模型。

关键词：皮层神经元；原代培养；Neurobasal；B27；细胞模型；新生大鼠

神经元具有高度分化、很少分裂的特点，从神经突起到成熟神经组织分离出神经元的过程中，神经元会受到不同程度的损伤，因此神经元体外原代培养是一项对实验要求较高、难度较大的培养技术。目前神经元原代培养方法很多，传统方法取材于胎鼠，主要是因为胎鼠胚胎时期神经元分化程度较低，体外生存能力强，取材中造成的不可逆损伤较小，便于成功培养；但胎鼠脑体积小，取材较为困难，且胎龄不易确定，故用新生鼠代替胎鼠进行原代培养已逐步被认可。出生24 h以内的新生鼠神经系统发育基本完成，很多神经元已长出突起，但是取材于该时期的脑组织对神经元的损伤较大，神经元死亡率较高，培养难度较大。2014年8月～2015年8月，我们在以往神经元培养方法[1～5]的基础上经过反复试验，对先前的培养方法加以改进，建立了一种简便的神经元原代培养方法。现报告如下。

1材料

出生24 h内的SD大鼠8只，雌雄不限，体质量约7 g，购于新疆医科大学实验动物中心。DEME高糖培养基、10% FBS购于上海联硕生物科技有限公司，Neurobasal、B27、青霉素和链霉素(10 000 U/mL)、L-谷氨酰胺、0.25%胰酶购于美国GIBCO公司，神经元特异性烯醇化酶(NSE)多克隆抗体购于英国ABCAM公司，L-多聚赖氨酸(PLL，1 mg/mL)、PBS购于上海生工生物工程有限公司。

2皮层神经元原代培养方法

2.1培养基制备接种培养基：DMEM高糖培养基+10% FBS+双抗(青霉素和链霉素，100 U/mL)。基础培养基：Neurobasal+2% B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺+双抗(青霉素和链霉素，100 U/mL)，4 ℃冰箱保存备用。

2.2培养皿预处理细胞培养前2～3天，对细胞培养的所有器皿进行预处理：对手术器械及枪头进行高压蒸汽灭菌30 min后，烘箱烘干备用；玻璃盖片先经自来水冲洗干净，烘箱烘干，再经浓硫酸浸泡过夜，自来水冲洗干净；再用双蒸水冲洗3遍，无水乙醇浸泡后，在超净台下酒精灯过火待全部乙醇蒸发。用尖镊夹取玻璃盖片放入6孔板内，每孔1张，加入1～2 mL PLL，37 ℃细胞恒温培养箱放置过夜。细胞培养前2 h，将6孔板内的PLL吸尽，PBS冲洗3次，吸尽PBS，放置于恒温培养箱内晾干备用。

2.3皮层神经元原代培养取出生24 h内的新生SD大鼠，在盛有75%乙醇的烧杯中清洗2次，每次1 min。在超净台下迅速断头取脑，置入预冷的玻璃皿中。左手持镊固定新生鼠头部，右手持眼科剪沿矢状缝剪开颅骨，用一把长镊剥除头皮及颅骨，充分暴露大脑皮层。用眼科镊在显微镜下小心剥离皮层的脑膜和血管，换用另一把眼科镊小心取下皮层组织，移入到预先加入1 mL DMEM高糖培养基的培养皿中，培养皿置于冰上。用眼科剪将皮层组织剪成约1 mm×1 mm的组织碎块，在培养皿中再加1 mL DMEM高糖培养基及2 mL 0.25%胰酶，在37 ℃细胞恒温培养箱中消化。培养5 min时轻轻摇晃培养皿，15 min时取出培养皿，将组织块吸入到提前预冷的离心管中，加入含10%FBS的DMEM高糖培养基2 mL终止消化。用1 mL进口枪头轻轻吹打未完全消化的组织块，待组织块完全吹散后，将吹打后的细胞悬液用200目筛网过滤，4 ℃离心(1 000 r/min)5 min，弃上清，加入含10%FBS的DMEM高糖培养基2 mL重悬细胞。待细胞成为悬液后，取10 μL细胞悬液加入到90 μL含10%FBS的DMEM高糖培养基，充分混匀。再加入等量台盼蓝染色，置于计数板上，倒置相差显微镜下计算细胞密度，以≥1×106个/mL密度接种到提前包被有PLL的6孔板中，每孔加入2 mL含10%FBS的DMEM高糖培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，4 h后用Neurobasal+2% B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺培养液全量换液1次，以后每3天进行半量换液。

3皮层神经元鉴定

3.1镜下形态学观察神经元接种培养后，在倒置相差显微镜下观察皮层神经元形态学变化，连续观察8天。皮层神经元接种时体积小，透亮，呈圆形，单个散在分布。接种后有少量细胞开始贴壁，2 h左右贴壁较多，少量细胞伸出短小的突起；4 h左右已基本贴壁，大量细胞伸出突起，周围光晕明显。培养3天时神经元突起明显伸长，相互交织，细胞透亮，立体感强，呈圆形、椭圆形、梭形。培养5～6天时神经元体积增大，突起交织成网状。培养7～8天时，神经元细胞体饱满，细胞质透亮，细胞核大而明显，细胞体周围折光性强，立体感好，突起交织成致密的网络结构。见插页图1。

3.2免疫荧光染色观察神经元培养7～8天，以抗NSE抗体为一抗，进行免疫荧光染色后对神经元进行鉴定：0.01%预冷的PBS浸洗细胞爬片2次，吸尽PBS；4%多聚甲醛固定5 min，PBS浸洗2次，每次5 min。3%双氧水封闭30 min，消除内源性过氧化物酶活性；PBS浸洗3次，每次5 min。山羊血清封闭30 min，加入NSE 一抗(1∶500)，4 ℃冰箱孵育过夜(约12 h)，PBS浸洗3次，每次5 min；加入二抗。避光孵育60 min后PBS浸洗3次，每次5 min；滴加PI染液(1∶1 000)100 μL，30 s后PBS浸洗2次，每次2 min，甘油(约30 mL)封片。激光共聚焦显微镜下取6个视野拍照，观察神经元形态，计算神经元密度；计数细胞总数，以荧光阳性细胞为神经元，纯度=神经元数/细胞总数×100%。细胞经NSE和PI免疫荧光双标染色后呈强阳性，激光共聚焦显微镜下观察，细胞质和突起被染成绿色、胞核被染成红色的为神经元，细胞核被染成红色而细胞质无染色的为非神经元，见插页图2。神经元密度为1.5×106个/mL，纯度>90%。

4讨论

体外培养的皮层神经元为一种广泛应用的细胞模型，可为研究脑血管病、神经系统疾病的发病机制及其治疗提供试验基础[6～9]。本课题组通过反复的试验，结合自身试验条件及以往细胞培养方法，建立了一种操作简单、细胞性质稳定、纯度较高的皮层神经元原代培养方法。现将经验总结如下。

4.1取材对象的选择目前神经元原代培养多采用新生鼠代替乳鼠，新生鼠的出生时间多选择在24 h以内，超过24 h的新生鼠皮层神经元虽然可以培养成活，但其中神经胶质细胞含量较多，抑制神经元的生长，甚至会导致神经元死亡[10,11],故本研究选用出生12 h以内的新生鼠，以提高神经元原代培养的成活率。

4.2培养基的选择神经元培养基主要有血清培养基和无血清培养基两种。用含10% FBS的DMEM高糖培养基为神经元提供生长所必需的营养成分，促进细胞的增殖。但神经元培养基也能为神经胶质细胞提供丰富的营养，在细胞贴壁后神经胶质细胞开始分裂生长，到12 h时开始大量分裂，抑制神经元生长。因此，在细胞接种时选择含10% FBS的DMEM高糖培养基，细胞接种后4 h时，神经元已基本贴壁，换用神经元专用培养基Neurobasal。Neurobasal可抑制非神经元的增殖，使神经元保持较好的细胞活性及生理特性[12,13],为神经元提供生长所需的营养物质。此外，Neurobasal中加入2% B27，可抑制胶质细胞有丝分裂，促进神经元的生长，使神经元保持较好的活性，从而提高其纯度。

4.3培养皿的处理神经元较其他细胞难以在体外存活和生长。本课题组经过多次试验发现，当细胞接种到未经PLL包被的培养皿后，细胞贴壁较慢，贴壁数量较少，大量细胞集聚成团悬浮在培养基中，且随着时间的推移，悬浮细胞大量死亡。而使用经PLL包被的培养皿，细胞接种后有少量细胞贴壁，2 h左右细胞贴壁较多，4 h左右已贴壁完全，神经元生长良好。因此，细胞接种前需用PLL包被培养皿，促进神经元的黏附及其贴壁生长。

4.4皮层神经元的提取皮层神经元的提取是培养成功的难点及关键步骤。首先要确保新生鼠是在出生24 h以内；其次在暴露新生鼠大脑皮层时应先用一把眼科镊沿大脑边缘由外向内小心彻底地将脑膜和血管剥除，剥除脑膜和血管的过程中，注意保持大脑皮层的干净和完整，然后换用另外一把无菌眼科镊夹取大脑皮层表面一薄层，并迅速置入培养基中。取样不可太厚，否则神经胶质细胞较多。整个过程中可将两把眼科镊置入预冷的DMEM高糖培养基中，一是为了清洗眼科镊上残留的组织，二是为了保持眼科镊的润滑度，便于提取皮层组织，提高细胞纯度，减少杂质。既往神经元培养在取材时，断头取脑后多采用PBS或D-Hank′s将血反复漂洗干净，然后再剥除皮肤及颅骨暴露双侧大脑半球，取出大脑半球置于显微镜下剥除脑膜和血管，其操作过程复杂，操作时间相对较长。本方法改进之处在于：①新生鼠经酒精消毒后，迅速断头取脑，快速剪开颅骨、剥除颅骨及头皮，充分暴露大脑皮层后，用两把不同的眼科镊分别取材，省去了漂洗的步骤，方法简便易行，为后续操作节省了时间；②用于取材的两把眼科镊分别置于预冷的培养基中，其中一把用于剥除脑膜和血管，另一把用于夹取大脑皮层组织，既避免了杂质污染，又便于皮层组织的提取，可进一步提高神经元的纯度。

4.5皮层组织消化将1 mL DMEM高糖培养基和2 mL 0.25%的胰酶混合，使胰酶稀释比例为0.125%。将组织块放入胰酶中进行消化，时间控制在15 min左右。5 min左右时晃动培养皿1次，使其充分混匀。若皮层组织较多，为使组织消化完全，可适当等比例增加DMEM高糖培养基和胰酶的用量。

4.6神经元接种接种密度影响神经元的生长。接种密度低时，神经元分布稀疏，联系减少，突触伸展较慢，神经元生长缓慢，而神经胶质细胞分裂明显；接种密度大时，神经元分布紧密，联系增多，突触增粗增长，相互交织成网状结构，可抑制非神经元生长。本研究神经元接种密度1×106个/mL。在细胞接种时，需将细胞悬液轻轻吹打，使神经元成为单个的细胞。吹打过程中动作要轻柔，不能有气泡，计数板计数后，均匀地接种在培养板中。接种后需按前后、左右、左上右下、右上左下方向摇匀细胞，细胞接种不均匀会使神经元成堆集中在培养板中央，细胞贴壁后由于拥挤致细胞大量死亡。

4.7B27的应用B27含有神经元生长所必需的多种生长因子和微量元素，一方面可以保证神经元生长所需的营养，另一方面可抑制神经胶质细胞的增殖，以提高神经元的纯度[14,15]。

总之，本研究建立的皮层神经元培养方法操作简便，其培养的神经元纯度高、密度大，可为今后的相关研究提供良好的细胞模型。

参考文献：

[1] 杨传豪,赵冬,王业忠,等.新生大鼠皮层神经元体外无血清原代培养[J].重庆医学,2014,43(29):3901-3903,3906.

[2] Majumdar D, Gao Y, Li D, et al. Co-culture of neurons and glia in a novel microfluidic platform[J]. J Neurosci Methods, 2011,196(1):38-44.

[3] Xu SY, Wu YM, Ji Z, et al. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons[J]. J Biomed Biotechnol, 2012,(2012):803930.

[4] Tang X, Zhou L, Wagner AM, et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells[J]. Stem Cell Res, 2013,11(2):743-757.

[5] 宋宁宁,宋丽,李剑,等.大鼠海马神经元原代培养方法及缺糖缺氧再灌注损伤模型的建立[J].山东医药,2013,53(48):24-26.

[6] Yang L, Yang ZM, Zhang N, et al. Neuroprotective effects of vitexin by inhibition of NMDA receptors in primary cultures of mouse cerebral cortical neurons[J]. Mol Cell Biochem, 2014,386(1-2):251-258.

[7] Ben Yakir-Blumkin M, Loboda Y, Schächter L, et al. Neuroprotective effect of weak static magnetic fields in primary neuronal culrures[J]. Neuroscience, 2014,(278):313-326.

[8] Zhang S, Jin Y, Liu X, et al. Methamphetamine modulates glutamatergic synaptic transmission in rat primary cultured hippocampal neurons[J]. Brain Research, 2014,(1582):1-11.

[9] 王瑞霞,蒋亮亮,马国诏,等.左旋丁基苯酞对Aβ1-42诱导的体外原代培养神经元损伤的影响[J].山东医药,2011,51(41):7-9.

[10] 姜茜,姜玉武,王静敏,等.一种改进的大鼠皮层神经元原代培养方法及其性质鉴定[J].北京大学学报(医学版),2009，41(2):212-216.

[11] 赵丽,陈瑶,龚丽景,等.乳鼠皮层神经元原代培养改良方法及基本电生理特性研究[J].北京体育大学学报,2012，35(10):42-45,75.

[12] Ballarin C, Peruffo A. Primary cultures of astrocytes from fetal bovine brain[J]. Methods Mol biol, 2012,814:117-126.

[13] Pacifici M, Peruzzi F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol[J]. J Vis Exp, 2012,24(63):e3965.

[14] Wang CP, Li GC, Shi YW, et al. Neuroprotective effect of schizandrin A on oxygen and glucose deprivation/reperfusion-induced cell injury in primary culture of rat cortical neurons[J]. J Physiol Biochem, 2014,70(3):735-747.

[15] Zhu QL, Li YX, Zhou R, et al. Neuroprotective effects of oxysophocarpine on neonatal rat primary cultured hippocampal neurons injured by oxygen-glucose deprivation and reperfusion[J]. Pharm Biol, 2014,52(8):1052-1059.

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胎牛血清(FBS)三磷酸腺苷(ATP)天冬氨酸转氨酶(AST)

丙氨酸转氨酶(ALT) 人类免疫缺陷病毒(HIV) 获得性免疫缺陷综合征(AIDS)

甲型肝炎病毒(HAV) 乙型肝炎病毒(HBV) 丙型肝炎病毒(HCV)

甘油三酯(TG) 总胆固醇(TC) 低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)

高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C) 核因子-κB(NF-κB) 磷酸盐缓冲液(PBS)

Establishment of a simple and convenient method for primary culture of cortical neurons

and identification of culture results

TANGShi-jun1,ZHAODong,ZHULi-cang,LIXiao-tian,ZHUWen-xue,YANGPeng,WANGYe-zhong

(1TheFirstAffiliatedHospitalofShiheziUniversityMedicalCollege,Shihezi832000,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a simple and convenient method for primary culture and to identify its validity. MethodsThe cortical tissues of SD rats born within 24 h were collected, and we got the neuronal cell suspension by trypsin digestion, explanted onto poly-L-lysine-coated plates with DMEM +HG + 10% FBS culture medium for 4 h, then the medium was replaced with neuronal culture medium with Neurobasal 2% B27+0.5 mmol/L glutamine. We observed the neuronal morphological changes for 8 days through inverted phase contrast microscope. Under the laser scanning confocal microscopy, neurons were cultured for 7 to 8 days, and the cells were identified by immunofluorescence staining. The density and purity of neurons were calculated. ResultsWhen the cortex neurons were inoculated, they were small, bright, translucent, round, and scattered in the distribution. After inoculation, a small amount of cells adhered to the wall, 2 hours later, more cells adhered to the wall, and a few cells produced short neurites; 4 hours later, most cells adhered to the wall, and a large number of cells produced neurites around the halo. After 3 days of cluture, the neurites were elongated, intertwined, transparent, and had strong three-dimensional sense with the round, oval and fusiform shapes. After 5 to 6 days, the cell bodies of the neurons increased, and the processes of the neurons wove into a network. After 7 to 8 days, the body of neuronal cell was full, cytoplasm was translucent, nucleus was large and obvious, the cell body had strong refraction, three-dimensional sense was good, and the processes wove into a network structure. The neuron density was 1.5×106/mL and the purity was more than 90%. ConclusionA simple and convenient method for primary culture was established with high purity and high density, which can provide a good cell model for the related scientific research.

Key words:neurons; primary culture; Neurobasal; B27; cell model; newborn rats

收稿日期：(2015-10-13)

中图分类号：R329.2

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)48-0019-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.48.006

通信作者简介：王业忠(1967-)，男，主任医师，研究方向为脑血管疾病及颅内肿瘤等。E-mail: wangyz2008@126.com

作者简介：第一唐仕军(1987-)，男，硕士，研究方向为脑血管疾病基础与临床。E-mail: 396112963@qq.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81360185)；新疆生产建设兵团博士基金资助项目(2011BB016)。