早期自然流产患者底蜕膜绒毛外滋养细胞中IGFBP7、VEGF的表达变化及意义

杨倩，卢丽莉，孟丽婵，宋春红

（1石家庄市第四医院，石家庄050011;2石家庄市第三医院）

妊娠早期母体子宫蜕膜化和胚胎绒毛的正常发育是建立有效母体—胎儿循环的关键因素，胚胎的绒毛外滋养细胞（EVT）侵入母体的蜕膜组织是影响胎盘及胎儿发育的重要环节之一［1］，EVT在妊娠早期主要位于胎盘着床部位，逐渐侵入子宫蜕膜组织及螺旋动脉，供应日益增长的胎盘及胎儿的营养需要。EVT增殖、迁移及浸润受很多局部信号分子的调节。体外实验表明，胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP7）及血管内皮生长因子（VEGF）对EVT发挥重要的调节作用［2，3］，同时有研究显示 IGFBP7可以通过调节VEGF的表达影响血管内皮细胞增殖和血管生成过程［4，5］。早期自然流产是妇产科常见的病理性妊娠，自然流产时 IGFBP7及 VEGF在EVT的表达情况国内外尚未见报道。本研究观察了早期自然流产患者EVT中IGFBP7、VEGF的表达变化，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2013年3月～2014年3月石家庄市第四医院收治的早期自然流产患者20例（观察组），年龄（28.2 ±3.4）岁，孕期（51.2 ±4.6）d;均经B超检查诊断为胚胎在宫内死亡尚未自然排出且病因不明者（女方基础体温呈双向，男方精液正常，夫妻双方与流产有关的检查均正常，包括染色体分析、内分泌激素及免疫学检测、盆腔超声等）。另选同期收治自愿要求进行人工流产健康妇女20例（对照组），年龄（27.5 ±2.6）岁，孕期（53.7 ±5.4）d;均无死胎、死产、自然流产史，本次妊娠期间无先兆流产的症状和体征，B超检查提示胚胎发育正常，无用药、病毒感染以及X线接触史。两组一般资料无统计学差异，具有可比性。

1.2 EVT中 IGFBP7、VEGF检测 ①标本采集及处理:两组均采用可视人工流产手术，从刮出物中取蜕膜及绒毛种植部位蜕膜组织（底蜕膜），生理盐水漂洗后，置于10%中性甲醛溶液中固定6～12 h，梯度乙醇脱水后石蜡包埋，5 μm切片。②HE染色及底蜕膜的辨别:在HE染色切片下观察底蜕膜组织中的EVT是无清晰边界的多角形细胞，含丰富的双染性胞质，核深染、不规则、具有轻度多形性。蜕膜细胞具有清晰的细胞膜，轻度嗜伊红的胞质和卵圆形的细胞核。当两者鉴别困难时，加用免疫组化染色CK和HPL加以鉴别。选取有底蜕膜成分的蜡块，切片进行免疫组化检测。③免疫组化染色:所用一抗为兔抗人IGFBP7 多克隆抗体（1∶200，Epitomics公司）及兔抗人VEGF多克隆抗体（福州迈新生物技术开发公司），运用 SP法检测两组底蜕膜 IGFBP7及VEGF。免疫组化检测试剂盒（SP-9001）和DAB酶底物显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。操作严格按免疫组化检测试剂盒说明书要求进行，DAB显色，苏木精复染。阴性对照以PBS代替一抗进行。④结果判断标准:采用双盲法在显微镜下（10×10）观察EVT着色情况，以细胞胞质内出现棕黄色颗粒为IGFBP7及VEGF表达阳性，每张切片随机观察10个视野。免疫组化染色结果采用半定量“Quickscore”法［6］判读，细胞染色强度:阴性计0分，弱阳性计1分，中等程度阳性计2分，强阳性计3分;视野内阳性细胞百分比:0～25%细胞着色计0分，25%～50%细胞着色计1分，50% ～75%细胞着色计2分，75% ～100%细胞着色计3分。细胞染色强度和密度的得分相乘再相加得到免疫染色评分（IRS）:0～12分的变化范围。

1.3 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。观察组IGFBP7与VEGF表达的相关性采用Pearson相关分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

观察组及对照组IGFBP7 IRS分别为（10.75±1.28）、（8.63 ±1.06）分，VEGF IRS 分别为（5.25 ±1.98）、（7.75 ±2.25）分，两组比较，P均 ＜ 0.05。Pearson相关分析显示，观察组IGFBP7与VEGF表达无相关性（r=-0.32，P=0.44）。

3 讨论

早期自然流产是临床常见的病理性妊娠，其发病率非常高，在对包括没有或几乎没有早期自然流产临床症状的孕妇在内的所有孕妇人群进行的前瞻性研究中，几乎50%的妊娠因自然流产而终止［7］。早期自然流产病因复杂，其与染色体异常、内分泌紊乱、解剖学异常等因素有关，但仍有部分病例发病机制不明。EVT侵入母体的蜕膜组织是影响胎盘绒毛发育及母体—胎儿循环建立重要环节之一，受激素、细胞因子等多种信号分子的调控，其中包括VEGF和 IGFBP7。

3.1 IGFBP7在EVT表达升高与早期自然流产的关系 IGFBP7广泛分布于全身各组织，是一种重要的胰岛素结合因子，还具有调控细胞活性、细胞分化和增殖等作用。IGFBP7在子宫间质细胞蜕膜化过程中起重要作用［8］，胚胎植入后IGFBP7在子宫的表达明显升高［9，10］。抑制 IGFBP7 的表达，小鼠怀孕率和孕卵着床率显著降低。抑制IGFBP7表达，培养的滋养细胞增殖和浸润能力亦减弱［11］。说明IGFBP7在调节母体的容受性、蜕膜化及胚胎植入过程中均发挥了重要作用，是维持生理性妊娠的重要调节因子之一。本研究显示，观察组EVT中IGFBP7 IRS高于对照组，我们推测其可能的机制有:①妊娠早期胚胎发育和胎盘形成是激素、细胞因子等多种因素调控的复杂而精密的过程，IGFBP7表达受到多种激素和细胞因子的影响，自然流产患者EVT中IGFBP7表达升高可能是多种因素综合作用的结果，以IGFBP7促进子宫蜕膜化及孕卵着床的保护性作用推测，自然流产时IGFBP7表达升高可能是机体启动的一种保护性补救机制。②IGFBP7的表达随着妊娠的进展而相应改变，如表达过度对胚胎发育和胎盘形成产生不利影响。Liu等［10］采用siRNA法使IGFBP7基因沉默后，培养的EVT分泌基质金属蛋白酶2（MMP-2）及MMP-9明显增多，即IGFBP7具有抑制MMP-2、MMP-9作用。胎盘形成过程中，MMP-2和MMP-9对细胞外基质Ⅳ型和Ⅴ型胶原的降解是滋养细胞侵入蜕膜的必要条件［11］。自然流产过程中，绒毛滋养细胞IGFBP7表达升高，可能以自分泌或旁分泌的方式过度抑制了MMP-2和MMP-9的表达，使EVT对细胞外胶原降解失调，抑制了EVT侵入蜕膜及对子宫螺旋小动脉的“血管重铸”，参与了流产的发生;因此自然流产时EVT中IGFBP7升高是促进流产发生还是一种保护性反应尚有待进一步研究。

3.2 VEGF在EVT表达降低与早期自然流产的关系 VEGF作为一种高效的促血管内皮细胞分裂原，广泛表达于蜕膜、绒毛及子宫内膜腺体［12］;在促进胎盘绒毛及蜕膜组织血管形成中起着重要作用，不仅如此，孕早期 EVT也存在VEGF 及其受体flt-1 的表达［13］;研究［3］显示VEGF还具有增加体外培养EVT增殖力的作用。本研究显示，观察组EVT中VEGF IRS低于对照组，说明VEGF有可能通过影响EVT的功能影响胎盘的发育。其可能通过如下机制参与了自然流产的发生:①EVT表达VEGF减少，可能抑制了EVT的增殖活性，使发育中的EVT数量不同程度减少，胎盘对子宫内膜的锚定作用和营养吸收功能减弱;②血管滋养细胞分泌VEGF减少，血管滋养细胞向螺旋小动脉侵入的过程受挫，抑制了子宫螺旋动脉的生理性转化，子宫螺旋动脉不能适时扩张，子宫血循环压力未能及时下降，影响了母胎交界的营养交换;③自然流产时，子宫处在相对缺氧的环境中，研究［8］表明VEGF在体外的绒毛膜癌细胞系BeWo通过激活Nrf2途径减少氧化损伤，VEGF的表达下降，使得EVT耐受缺氧应激的能力下降，EVT结构和功能受损;当上述机制累积到一定程度最终可能使得流产发生。

3.3 IGFBP7与VEGF的相互关系及其与早期自然流产的关系 本研究显示，观察组IGFBP7、VEGF表达无相关性。但有研究显示，IGFBP7在不同的研究中对VEGF表达具有相反的调节效果。自然流产时，EVT同时存在IGFBP7表达升高和VEGF表达下降，我们分析有如下可能性:①自然流产时IGFBP7升高是一种保护性反应。Liu等［10］发现，特异性抑制IGFBP7的表达后，孕7 d小鼠子宫VEGF表达明显减少，说明IGFBP7具有上调VEGF表达的作用，自然流产的绒毛和蜕膜组织由于VEGF表达减少，胎盘形成部位血管生成不良，EVT处于相对缺氧的微环境，IGFBP7作为妊娠保护性分子被激活而表达增多，但其刺激VEGF的作用不足或存在某种信号机制障碍未能使VEGF的表达上调，IGFBP7升高不足以扭转胎盘缺血缺氧的局面，流产难免发生。②IGFBP7过表达抑制了VEGF表达，促进了自然流产的发生。Tamura等［4］研究表明，IGFBP7可通过抑制VEGF的表达抑制培养的血管内皮细胞的血管生成，并通过抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和环氧化酶（COX-2）途径抑制VEGF诱导的大鼠卵巢早期黄体微血管内皮细胞的增殖和管腔形成［5］。人胎盘血管生成大约发生在受精后32 d～25周，VEGF在这一过程中发挥了重要作用，自然流产时IGFBP7表达的升高可能通过抑制MAPK和COX-2途径抑制VEGF的表达，从而影响绒毛及底蜕膜微血管的形成，胎盘血管网络构建不良，导致流产的发生。

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