不同浓度阿司匹林对成骨细胞增殖的影响

王昌超，成业东，黄亚东，高超，姜鹏，冯海波，王加波，黄妍

(1中国人民解放军第82医院，江苏淮安223001;2江苏食品药品职业技术学院)

骨质疏松症是中老年人的常见疾病之一，严重影响中老年人，特别是老年女性的健康和生活质量。目前，抗骨质疏松药物种类较多，但在应用过程中多存在不良反应大、疗程长、疗效不佳等问题，患者治疗依从性较差。有研究发现，低浓度阿司匹林服用一年以上能提高老年人的骨密度［1］，说明阿司匹林具有潜在的抗骨质疏松作用，但目前相关研究报道较少。2011～2014年，我们观察了不同浓度阿司匹林对成骨细胞增殖和凋亡的影响，旨在为阿司匹林治疗骨质疏松症提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人成骨细胞株(hFOBI.19)，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。主要试剂:阿司匹林(美国Sigma公司)，置于无菌注射用水溶解，加入NaOH滴定至pH 7.0，配制成浓度为100 mmol/L阿司匹林溶液;DMEM/F12培养基，美国Gibco公司;FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司;CCK-8试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 成骨细胞体外培养 成骨细胞复苏后接种于底面积为75 cm2培养瓶中，加入10 mL DMEM/F12培养基和1 mL FBS，置于34℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后细胞贴壁生长，每2～3天换液一次，第8～10天细胞长满瓶底后传代，取传3～6代的成骨细胞用于实验。

1.3 成骨细胞增殖活性检测 采用CCK-8法。调整细胞密度至2×105个/mL，接种于96孔板，每孔100 μL。饱和湿度下，34℃、5%CO2培养箱中培养。细胞贴满瓶底后，随机分为阿司匹林低、中、高浓度组及对照组。阿司匹林低、中、高浓度组分别加入含终浓度为0.5、2、10 mmol/L阿司匹林的培养液［2］200 μL，对照组只加入培养液(含 10%FBS 的DMEM/F12培养基)200 μL，同时设空白对照组。每组设8个复孔。干预24 h，PBS洗涤3次，每孔按1∶9比例加入CCK-8溶液及培养液共100 μL，培养4 h，分光光度计检测450 nm波长处吸光度值(OD值)，即代表成骨细胞的增殖活性。

1.4 成骨细胞凋亡检测 调整细胞密度至2×105个/mL，接种于6孔板中，每孔2 mL。培养至细胞长满培养瓶底，随机分为阿司匹林低、中、高浓度组及对照组。阿司匹林低、中、高浓度组分别加入终浓度为 0.5、2、10 mmol/L 阿司匹林的培养液 2 mL，对照组不予处理。培养24 h收集细胞，加入400 μL Binding Buffer轻轻重悬细胞，加入AnnexinV-FITC 5 μL室温避光孵育15 min，600 r/min离心沉淀5 min，将沉淀细胞用孵育缓冲液洗涤1次，加入10 μL PI染色液，冰浴避光放置10 min，流式细胞仪检测成骨细胞凋亡率。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，计量资料以±s表示，结果比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组成骨细胞增殖活性比较 阿司匹林低、中、高浓度组 OD 值分别为 0.740 ±0.040、0.780 ±0.034、0.480 ±0.058，对照组为 0.620 ±0.031。阿司匹林低、中浓度组成骨细胞增殖活性明显高于对照组、阿司匹林高浓度组(P均＜0.05)，阿司匹林高浓度组明显低于对照组(P＜0.05)，而阿司匹林低、中浓度组差异比较无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 各组成骨细胞凋亡率比较 对照组成骨细胞凋亡率为10.35% ±0.39%，阿司匹林低、中、高浓度组分别为 8.30% ±0.35%、9.96% ±0.34%、11.3% ±0.35%。阿司匹林低、高浓度组与对照组比较差异有统计学意义(P均＜0.01)，阿司匹林中浓度组与对照组差异比较无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

成骨细胞是骨形成过程中的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。成骨的关键是成骨细胞处于功能活跃状态。成骨细胞数量增加及功能增强均能发挥抗骨质疏松的作用。因此，抗成骨细胞凋亡或改进成骨细胞功能成为治疗骨质疏松症的有效方法［3］。

Yamaza等［4］研究证实，低浓度阿司匹林能改善去势小鼠骨小梁和皮质骨密度;Wei等［5］进行的动物实验进一步证实，阿司匹林具有促进成骨作用［5］。临床研究也发现，长期口服阿司匹林能提高老年患者的骨密度［1］。但阿司匹林抗骨质疏松的作用机制尚未完全阐明［6］。有研究认为，阿司匹林可通过刺激骨形成途径促进骨小梁的改建，改善骨小梁的三维结构，增加骨密度及力学强度［7］;通过COX-2酶、PGE2等参与成骨细胞合成［8］，促进成骨细胞增殖、成熟、矿化［9，10］。目前公认的抗骨质疏松经典通路为RANK-RANKL骨保护素和Wnt通路。阿司匹林影响Runx2表达，而Runx2刺激BMP2形成，通过 RANK-RANKL通路起抗骨质疏松作用［11，12］。阿司匹林可阻止 RANKL 诱导的骨质疏松，加速退化磷酸蛋白的降解，增加Wnt信号的水平，从而通过Wnt通路起抗骨质疏松作用［3］。Urganus等［13］认为，长期服用阿司匹林去势小鼠RANKL减少和OPG增加。因此推测，阿司匹林可用于骨质疏松的治疗。

本研究发现，阿司匹林低、中浓度组可促进成骨细胞增殖，阿司匹林低浓度组还能抑制成骨细胞凋亡，而阿司匹林中浓度组对成骨细胞凋亡无明显影响;阿司匹林高浓度组可抑制成骨细胞增殖，促进成骨细胞凋亡。结果表明，低浓度阿司匹林能促进成骨细胞增殖，并抑制其凋亡，对骨质疏松治疗有效。

综上所述，低浓度阿司匹林能促进成骨细胞增殖、抑制其凋亡，有可能用于骨质疏松的预防及治疗。此外，阿司匹林作为中老年人的常用药，不良反应少、价格便宜，有更广泛的应用前景。

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