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HPLC法测定芪月降脂片中两种泽泻醇的含量

2015-04-04姜南辉

河北医药 2015年11期
关键词:泽泻降脂乙腈

姜南辉

芪月降脂片是利用现代中药有效成分提取法提取泽泻、黄芪、月见草油等中药中的有效部位,再采用现代药物制剂技术将其制成制剂的纯中药降脂新药[1]。药效学研究表明,芪月降脂片明显降低高脂血症大鼠血清胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白含量,提高高密度脂蛋白的含量,同时降低肝脏中甘油三酯以及丙二醛含量[2]。泽泻的主要成分为原萜烷型四环三帖类化合物即泽泻醇类化合物[3,4],其中泽泻醇 A-24-乙酸酯、泽泻醇B-23-乙酸酯为其利尿、降血脂等作用的主要有效成分[5]。本实验以泽泻醇 A-24-乙酸酯、泽泻醇B-23-乙酸酯作为芪月降脂片质量控制的主要指标,建立了HPLC含量测定方法,为芪月降脂片的质量评价提供科学依据。

1 仪器与试药

Agilent-1100型高效液相色谱仪;G1314A紫外检测器,N2000色谱工作站;CP225D型电子天平;泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯对照品均由本实验室自制,采用HPLC峰面积归一化法测定,其纯度均大于98%;芪月降脂片为自制,批号为121106、121118、121130;乙腈为色谱纯,水为高纯水,其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Accurasil-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为乙腈-水(78∶22);检测波长208 nm;流速为0.8 ml/min;柱温为室温;进样量10 μl。

在此色谱条件下,泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯均具有良好的分离度,且与其邻峰的分离度均大于1.5,基线噪音小。见图1。

A.对照品;B.样品;1.泽泻醇A-24-乙酸酯;2.泽泻醇B-23-乙酸酯图1 对照品(A)及样品(B)HPLC色谱图

2.2 对照品溶液的制备 精密称取泽泻醇A-24-乙酸酯、泽泻醇B-23-乙酸酯对照品适量,加乙腈溶解,制成含泽泻醇 A-24-乙酸酯、泽泻醇 B-23-乙酸酯分别为152.6,166.8 μg/ml的对照品混合溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取芪月降脂片10片,研细,精密称取0.50 g,置100 ml具塞锥形瓶中,精密加入乙腈100 ml,密塞,称定重量,超声处理30 min,取出,放冷,再称定重量,用乙腈补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液。

2.4 线性关系考察 精密量取“2.2”项下对照品溶液 5,10,15,20,25 μl,注入液相色谱仪,测定峰面积。以色谱峰面积(Y)对进样量(X)进行线性回归,绘制标准曲线。泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯的回归方程分别为:

Y=11.09 X+2.697,r=0.9998

Y=15.66 X+9.087,r=0.9996

结果表明,泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯分别在0.763~3.815 μg和0.834 ~4.170 μg范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 取同一对照品溶液,在上述色谱条件下重复进样6次,每针进样10 μl,泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇 B-23-乙酸酯峰面积的 RSD分别为1.55%、0.97%。表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 精密称取同一批样品6份,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,在上述色谱条件下测定,计算泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯的平均含量分别为0.26%、0.43%;RSD分别为0.97%、1.65%。表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液,分别于0、2、4、8、12、24 h测定。泽泻醇 A-24-乙酸酯和泽泻醇 B-23-乙酸酯峰面积的RSD分别为1.15%、1.85%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的芪月降脂片细粉6份,每份约0.25 g。分别准确加入泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯的对照品溶液适量,按“2.3供试品溶液的制备”项下方法进行制备,即得供试液。在上述色谱条件下测定,记录色谱峰面积。泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯的平均回收率分别为99.72%、99.53%;RSD分别为 0.50%、0.72%。表明方法的准确度良好。见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.9 含量测定 取3个不同批号的芪月降脂片(121106、121118、121130),按上述供试品溶液制备方法和色谱条件,制备供试品溶液并注入液相色谱仪进行测定。计算泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯的含量。见表2。

表2 泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯含量

3 讨论

3.1 提取时间的选择 按“2.3供试品溶液的制备”项下操作,分别考察超声提取10、20、30、40、50 min 对药品测定结果的影响,结果表明提取时间30 min就可以达到基本提取完全。

3.2 检测波长的选择 泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯均为原萜烷型四环三萜类化合物,表现为紫外末端吸收,且在208 nm处有最大吸收峰。虽为紫外末端吸收,但其响应较好,因此采用吸收波长208 nm作为检测波长。

3.3 流动相的选择 泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯化学结构十分接近,试验用过乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙腈-水等不同的流动相体系,结果发现乙腈-水流动相系统可较好地满足实验需求,经反复试验,当乙腈-水的比例为78∶22时,色谱图有较好的分离度、峰形。

芪月降脂片中化学成分众多,其中泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯含量都比较大,且性质稳定,可用于定性、定量研究。本实验首次建立了采用HPLC方法同时测定芪月降脂片中泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯的含量。该方法操作简单,具有分离效果好、灵敏度高、准确性好、操作简单等优点,可以用于芪月降脂片的质量控制。

1 张善玉,金在久,康东周,等.高效液相色谱法测定芪月降脂片中金丝桃苷的含量.延边大学医学学报,2004,27:177-179.

2 申英爱,张善玉,金在久.芪月降脂片对小鼠的急性毒性反应实验研究.延边大学医学学报,2004,27:29-30.

3 罗张炎,周爱存,张朝凤,等.HPLC同时测定泽泻中4种泽泻醇成分的含.中国中药杂志,2010,35:3306-3309.

4 易醒,黄丹菲,肖小年,等.泽泻的研究现状与展望.时珍国医国药,2007,18:331-333.

5 陆霄鹤.HPLC法测定生泽泻、盐泽泻中24-乙酰泽泻醇A的含量.内蒙古中医药,2013,32:43.

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