骨髓间充质干细胞及其对脊髓损伤的治疗

曹 娟，李秀云，李春兰，隋晓娜，唐 静

1 脊髓间充质干细胞（BMSC）的特性

1.1 BMSC起源及体外分离、培养和鉴定

1.1.1 BMSC起源 BMSC是一种最早从骨髓中分离的成体干细胞，因其能够诱导分化为中胚层来源的间质细胞而得名。BMSC属成人干细胞，又称成纤维细胞集落形成单位 （fibroblastic colony forming unit，FCFU）或间质祖细胞（mesenchymal progenitor cells，MPC），因主要存在于结缔组织和器官间质，骨髓为主要来源，统称为BMSC。Minguell等将BMSC概括为：存在于脊髓间充质内的非造血来源的细胞亚群，可在体外扩增，并可诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、肌管、神经细胞与支持造血的干细胞的基质。

1.1.2 分离 目前BMSC的体外分离主要用细胞表面分子标记分选法、细胞贴壁筛选法、密度梯度离心法、细胞筛筛选法等。细胞表面分子标记分选法分离细胞的纯度与所选择的表面活性分子密切相关，但目前仍未发现特异性的BMSC表面标记，单克隆抗体磁珠分离系统和流式细胞术也可用于细胞分离，但降低细胞活性。细胞贴壁筛选所分离的BMSC纯度较低，而且传代培养也难以去除杂质。目前应用较为广泛的是细胞贴壁筛选法加密度梯度离心法。

1.1.3 培养 BMSC具有自我更新和多向分化潜能，传代培养，细胞形态均一，生长方式为贴附型，形态类似于成纤维细胞，呈梭形、纺锤形，克隆样生长，培养至9代后生长减慢，胞质空泡化、胞体变大等老化现象[1]。目前使用最为广泛的BMSC培养基含10%胎牛血清的低糖DMEM，10%胎牛血清和1%双抗，以95%饱和湿度，37℃ CO2孵箱培育。扩增BMSC时常用标记方法包括荧光标记法；化学标记法；Y染色体标记法等方法。化学及荧光标记技术简单、专一性强、标记效率高，但适用于短期标记移植细胞；而且荧光标记只能判定细胞的存在，无法观察细胞形态。再者，标记细胞凋亡或死亡后会释放标记物，一方面可标记周围细胞，造成假阳性，一方面如果被巨噬细胞吞噬，细胞碎片也可以有荧光表达。对标记细胞在同一动物、不同时间活体内的追踪常用放射性核素标记法、超顺磁性三氧化二铁纳米微粒（SPIO）标记法、生物发光活体成像技术。MRI活体示踪磁性标记细胞，可对BMSC迁移、增殖、分化进行监测，但不同部位的移植细胞需采用不同显影剂，应用受限。此外还有细胞膜标记、Hoechst标记等方法。

1.1.4 鉴定 在表型上，至今仍未发现BMSC有特异性的表面标记物。目前主要通过两种方法鉴定：形态学特征及生长特点成纤维细胞样生长，如前所述；再者即排除法：BMSC在体外实验中主要根据其分化为间充质干细胞系如脂肪细胞、成软骨细胞等[2]；以及表达特定的细胞表面标志物鉴定：BMSC表达多种表面标志物，包括细胞外基质成分、细胞因子、生长因子及其受体等，但造血及内皮细胞表达的抗原阴性。流式细胞术检测发现，与造血、内皮细胞一致的标志物（尤其是CD45、CD34等），BMSC 表达阴性，而与基质细胞和间质细胞一致的标志物如CD44、CD29、CD13等表达阳性。 虽然国际细胞治疗协会 标 准 ，BMSC 应 表 达 CD106、CD90、CD73； 不 表 达CD45，CD19，CD19或 CD79，CD14或 CD11b，也不表达成纤维细胞的组织相容性抗原－DR 型（HLA－DR）等[3]，但目前其具体表型标志还不明确，这一标准也不是唯一参数。

1.2 BMSC的生物学特性

1.2.1 形态和生长方式 BMSC在形态上呈现为成纤维样或不规则样，胞质丰富，核染色质细，核仁明显，平行排列或旋涡样生长。

1.2.2 自我更新 BMSC具有较强的端粒酶活性，可通过不对称分裂方式增殖，实现分化、增殖，维持自身干细胞的数量。

1.2.3 多向分化潜能 已有研究表明，BMSC可以向中胚层、外胚层、内胚层分化。

1.3 BMSC的免疫学特性及免疫修复机制

1.3.1 BMSC的免疫抑制性 BMSC具有弱免疫原性，仅表达中等水平的主要组织相容性抗原Ⅰ（HLA－Ⅰ）类分子，不表达 HLA－Ⅱ类分子、Fas配体和 B7－1、B7－2、CD40、CD40L等协同刺激分子，能够逃避移植受者免疫系统的识别。BMSC可通过分泌可溶性因子或外界激活／刺激而对移植受者产生负性免疫调节作用，当BMSC与同种异体组织接触并释放可溶因子免疫抑制最有效。BMSC可诱导T淋巴细胞失能，表现为不能增殖以及在抗原刺激后通常是在没有足够刺激后，不分泌细胞因子，抑制树突状细胞（DC）的发育及功能，向成骨细胞分化后的BMSC仍具有免疫调节功能[4]。BMSC还诱导Th1减少INF－γ分泌，诱导Th2分泌IL－4。在Ⅱ型胶原诱导关节炎中，给予同种异体BMSC可能通过降低T细胞增殖反应、降低血清IL－4、INF－γ水平等途径阻止软骨和骨的不可逆性免疫破坏[5]。对于B细胞，BMSC可通过抑制B细胞与NK细胞的增殖和活化而发挥免疫抑制效应[6]。BMSC可通过产生介质抑制B细胞的增殖和分化，使B淋巴细胞停留在G0／G1期，从而产生抑制作用；或下调B细胞趋化因子受体等途径减弱B细胞向炎症部位募集[7]。在混合淋巴细胞培养中，BMSC能够抑制T细胞和B细胞增殖。BMSC对DC的抑制作用表现为，共同培养BMSC与DC时，发现DC衍生物CD14＋单核细胞反应减弱，成熟DC标志CD83的表达减少，抑制单核细胞系向抗原提呈细胞分化，或通过阻断细胞周期而抑制树突状细胞的分化和功能[8]。

1.3.2 BMSC的免疫刺激作用 在血液、脾脏的淋巴细胞中，BMSC有轻度增加IgG和INF－γ分泌的作用。新近研究表明，人和小鼠的BMSC在体外用γ干扰素和异种可溶性蛋白质处理后，能充当抗原提呈细胞，并通过HLA－Ⅱ类分子途径产生保护性的免疫反应。

2 BMSC治疗与SCI后脊髓修复

2.1 脊髓损伤后功能恢复的机制 轴突损伤后，即使神经元胞体仍然存活，神经元功能也可能缺失。用BMSC对损伤脊髓干预，旨在通过改变SCI后的病理过程从而促进脊髓功能恢复，可能修复机制主要包括：①分化成受损神经组织细胞，达到结构和功能的恢复[9]：但目前仍然备受争议，部分学者不赞同 BMSC 神经分化观点[10，11]；②分泌生长因子和细胞因子，为轴突或神经元再生提供最佳微环境：损伤脊髓内的神经生长因子、血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子等营养因子的含量明显增高，神经元轴突再生明显；神经营养因子是神经系统中重要的调节蛋白，可调节神经元的存活、轴突生长、突触可塑性和神经递质的产生，但这些因子受到神经胶质瘢痕抑制，因此它们改变脊髓损伤的微环境作用是有限的[12－15]；③移植材料填充损伤部位并形成细胞桥，从而为损伤轴突的再生提供机械或生物通道[16]；④减轻急慢性炎症反应，免疫抑制，保护组织，加强感觉运动功能的恢复：减轻脊髓损伤急性炎症反应，防止再损伤的发生和星形胶质细胞、小胶质细胞和巨噬细胞的反应[17，18]。

2.2 BMSC移植治疗SCI的动物 BMSC移植治疗SCI的动物实验，将BMSC体外诱导分化为Schwann细胞移植入损伤7d后的小鼠脊髓，损伤脊髓囊腔变小，轴突再生，小鼠后肢功能恢复显著。Bakshi等发现，选用表达人胎盘碱性磷酸酶的转基因大鼠，将获取的BMSC经腰穿移植入SD大鼠的SCI部位，能够减少SCI囊变和再损伤的发生，而将人BMSC用于治疗脊髓半横断损伤的大鼠，无须进行免疫抑制，大鼠可存活数月，并且没有出现炎症或免疫排斥反应[19]。将BMSC经静脉注射用于成体动物，BMSC可迁移到中枢神经系统内，表达神经元特异性标志物，如神经核蛋白（NeuN）、βⅢ微管蛋白（Tubulin2βⅢ）等，因而被认为已经分化为成熟的星形胶质细胞和神经元，有望形成新的神经环路。通过大量的啮齿类和灵长类动物实验证实BMSC对脊髓损伤部分功能恢复是有效的，并且是安全的，这为BMSC的临床应用奠定了基础。

2.3 BMSC 临床应用

2.3.1 完全性、不完全性脊髓损伤 移植治疗不完全性脊髓损伤患者，肌肉力量，关节僵硬，感觉，尿便自控力，少数患者性功能等方面会有较为明显的改善。完全性损伤则治疗效果很有限：感觉障碍范围缩小，肌张力降低和轻度肌力提高[20]。

2.3.2 脊髓损伤的急性期、亚急性期和慢性期 急性期或亚急性期BMSC临床治疗较以往传统治疗都取得了较理想的功能恢复。对于慢性期患者，大部分研究证实BMSC治疗效果不明显。即便有少数患者在注射BMSC后立即出现感觉或功能好转，但这些改善也往往会在之后的3～4个月消失[21]。暂时的感觉和功能的改善主要是因为BMSC注射时，硬脊膜被轻微的损伤刺激、脑脊液暂时恢复、休眠的神经元被刺激、神经胶质瘢痕的断裂引起的，而不是因为BMSC的植入。因为BMSC植入后细胞扩增及各种因子的分泌都有一定的潜伏期。国内研究证实完全性脊髓损伤接受移植治疗的时间超过伤后3年，则治疗效果很有限，最常见的改善是感觉障碍范围缩小、肌张力降低和轻度肌力提高[20]。

目前BMSC治疗SCI的具体机制尚不十分清楚，虽然多数的动物实验和临床研究证实BMSC移植治疗后，SCI导致的神经功能缺失症状能明显得以改善，但临床试验中获得显著功能改善的结论很少。RakhiPal等[22]通过长期随访证实经BMSC治疗的SCI患者没有明显的不良反应及带来额外的并发症，而且都有不同程度的功能恢复，证实骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤是安全的，但这一结果还需要大量临床报告证实。因治疗而导致的神经性疼痛或肿瘤等并发症正处于进一步研究阶段。目前干细胞联合治疗方案已经成为SCI治疗的一种新趋势。

2.3.3 BMSC治疗的方式及时机的选择 静脉注射法是一种更为便捷的方法，但是细胞注射到血液中，只有很少一部分能植入脊髓内，到达损伤局部的更是微乎其微；局部注射法注射的BMSC能最大限度地移植入脊髓损伤部位，进而发挥促进修复的作用；腰穿注射BMSC能够通过脑脊液循环到达脊髓损伤局部，并且可以进入脊髓内部，是目前最好的移植方法；定向诱导分化为神经元或者神经胶质细胞后再进行细胞移植，或许是一种更为有效的治疗方法；还可联合其他细胞、细胞因子、组织工程支架、药物移植。

脊髓损伤后，几分钟内局部即可发生形态学改变。伤后1h，前角细胞出现中央染色溶解和缺血。伤后4h，出血呈离心性，伤后21h有明显脱髓鞘改变，出现多形核白细胞浸润等改变继而并发继发性损伤，这一急性过程约持续7d左右。细胞移植过早，因急性期血脑屏障破坏严重的炎症免疫反应会导致移植的干细胞坏死；过晚由于脊髓损伤部位胶质瘢痕形成，神经纤维难以再生。因此许多学者则认为10～14d亚急性阶段为BMSC最佳的治疗时间[21]。但有研究证实鼠脊髓损伤后6h至28d不同时间点经BMSC治疗，行为测试结果证实6h及1、3d早期治疗结果好于后期[23]。但也有观点认为SCI的急性期、亚急性期及慢性期都可适用于BMSC治疗：BMSC可调节急性期剧烈的炎症反应，在亚急性及慢性期降低神经胶质瘢痕抑制，为轴突再生提供持续的最佳微环境[15]。目前干细胞治疗脊髓损伤的机制探讨不是很明确，因此治疗的最佳时机仍需通过大样本、长期临床观察方能确定。

3 问题及展望

BMSC移植治疗SCI在临床仍处于起步阶段，有很多问题亟待阐明：①BMSC的自身基因调控机制；②BMSC与宿主神经组织相互融合的机制；③BMSC分化而来的神经细胞是否具有完整的神经元功能，移植后的神经细胞之间能否建立精确的联系；④尽管大量动物实验及临床试验已经证明BMSC移植治疗SCI可显著促进神经功能恢复，但应如何进一步明确及提高疗效；⑤BMSC移植治疗的临床应用亟须大样本的随机对照研究以确认远期效果及安全性（肿瘤化与分化诱导）；⑥BMSC的临床试验设计，SCI患者选择，SCI治疗结果评价等需要根据临床前的实验进一步的优化。

尽管如此，复习文献可知BMSC具有强大的增殖能力和多向分化潜能，可向非间质细胞谱系如神经细胞分化的潜能，易于培养，移植后免疫性低，能够通过改变SCI后的病理过程从而促进脊髓功能恢复且伦理问题争议少，对SCI疾病的防治前景较为广阔。

[1] 李念龙，于占革.骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展[J].中国矫形外科杂志，2012，10（04）：62－64.

[2] Dominici M，Le Blanc K，Mueller I，et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells，the international society for cellular therapy position statement[J].Cytotherapy，2007，9（3）：301－302.

[3] Benayahu D，Akavia UD，Shur I.Differentiation of bone marrow stroma derived mesenchymal cells[J].Curr Med Chem，2007，14（2）：173－179.

[4] Di Nicola M，Carb－Stella C，Magni M，et al.Human bone marrow stromal cells suppress T－lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli[J].Blood，2002，99（10）：3838－3843.

[5] Augello A，Tasso R，Negrini SM，et al.Cell therapy using allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells to prevent tissue damage in collagen－induced arthritis [J].Rheum，2007，56（4）：1175－1186.

[6] Maggini J，Mirkin G，Bognanni I，et al.Mouse bone marrowderived mesenchymal stromal cells turn activated macrophages into a regulatory－like profile[J].PLoS One，2010，5（2）：e9252.

[7] Corcione A，Benvenuto F，Ferretti E，et al.Human mesenchymal stem cells modulate B－cell functions[J].Blood，2006，107（1）：367－372.

[8] Djouad F，Charbonnier LM，Bouffi C，et al.Mesenchymal stem cells inhibit the differentiation of dendritic cells through an IL－6－dependent mechanism[J].Stem Cells，2007，5（8）：2025－2032.

[9] Pedram MS，Dehghan MM，Soleimani M，et al.Transplantation of a combination of autologous neural differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells into injured spinal cord of rats[J].Spinal Cord，2010，48（6）：457－463.

[10] Weidong Gu，Fujun Zhang，Qingsheng Xue，et al.Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells reduces lesion volume and induces axonal regrowth of injured spinal cord[J].Neuropathology，2010，30（3）：205－217.

[11] Parr AM，Kulbatski I，Wang XH，et al.Fate of transplanted adult neural stem／progenitor cells and bone marrow derived mesenchymal stromal cells in the injured adult rat spinal cord and impact on functional recovery[J].Surg Neurol，2008，70（6）：600－607.

[12] Parr AM，Tator CH，Keating A.Bone marrow derived mesenchymal stromal cells for the repair of central nervous system injury[J].Bone Marrow Transplant，2007，40（7）：609－619.

[13] Kamei N，Tanaka N，Oishi Y，et al.Bone marrow stromal cells promoting corticospinal axon growth through the release of humoral factors in organotypic cocultures in neonatal rats[J].Neurosurg Spine，2007，6（5）：412－419.

[14] Sasaki M，Radtke C，Tan AM，et al.BDNF－hyper secreting human mesenchymal stem cells promote functional recovery，axonal sprouting，and protection of corticospinal neurons after spinal cord injury[J].Neurosci，2009，29（47）：14932－14941.

[15] Wright KT，El Masri W，Osman A，et al.Concise review：Bone marrow for the treatment of spinal cord injury：mechanisms and clinical applications[J].Stem Cells，2011，29（2）：169－178.

[16] Wright KT，El Masri W，Osman A，et al.Bone marrow stromal cells stimulate neurite outgrowth over neural proteoglycans（CSPG），myelin associated glycoprotein and Nogo－A[J].Biochem Biophys Res Commun，2007，354（2）：559－566.

[17] Abrams MB，Dominguez C，Pernold K，et al.Multipotent mesenchymal stromal cells attenuate chronic inflammation and injury－induced sensitivity to mechanical stimuli in experimental spinal cord injury [J].Neurosci，2009，27（4）：307－321.

[18] Auletta JJ，Deans RJ，Bartholomew AM，et al.Emerging roles for multipotent，bone marrow －derived stromal cells in host defense[J].Blood，2012，119（8）：1801－1809.

[19] Bakshi A，Barshinger AL，Swanger SA，et al.Lumbar puncture delivery of bone marrow stromal cells in spinal cord contusion：a novel method for minimally invasive cell transplantation[J].Neurotrauma，2006，23（1）：55－65.

[20] 徐 瑶，肖晓山.干细胞移植治疗脊髓损伤的研究[J].现代医院，2012，12（6）：7－9.

[21] Yoon SH，Shim YS，Park YH，et al.Complete spinal cord injury treatment using autologous bone marrow cell transplantation and bone marrow stimulation with granulocyte macrophagecolony stimulating factor： Phase I／II clinical trial[J].Stem Cells，2007，25（8）：2066－2073.

[22] Pal R，Venkataramana NK，Bansal A，et al.Ex vivo－expanded autologous bone marrow－derived mesenchymal stromal cells in human spinal cord injury／paraplegia：a pilot clinical study[J].Cytotherapy，2009，11（7）： 897－911.

[23] Osaka M，Honmou O，Murakami T，et al.Intravenous administration of mesenchymal stem cells derived from bone marrow after contusive spinal cord injury improves functional out come[J].Brain Res，2010，1343（2）：226－235.