馥感啉口服液抗肠道病毒71型的药效学研究

馥感啉口服液抗肠道病毒71型的药效学研究

乔红伟, 陈威, 高虹

(中国医学科学院医学实验动物研究所 北京协和医院比较医学中心

卫生部人类疾病比较医学重点实验室, 北京, 100021)

关键词:馥感啉口服液; 肠道病毒71型; ICR小鼠; 药效学

近年来手足口病(HFMD)的发病率在中国呈上升趋势，其中重症和死亡病例肠道病毒71型(EV 71)感染率显著增高，EV 71的危害性值得警惕和重视[1]。EV 71属于小RNA病毒科，是引发手足口病最主要的病原体，通过消化道入侵后在肠壁细胞中增殖，然后进入血液循环引起全身病毒血症[2]。普通型手足口病症状较轻，主要表现为手掌、脚掌、口腔黏膜等部位的斑丘疹、疱疹，但该病毒可入侵神经系统引起呕吐、眼球震颤、肌阵挛、共济失调、心动过速甚至死亡，其危害仅次于脊髓灰质炎病毒[3-4]。患儿和病毒携带者均可作为传染源，因此容易在托幼机构和学校等幼儿密集场所爆发，严重威胁全球儿童的身心健康和生命安全[5]。目前，临床上尚无有效的抗EV 71病毒药物或疫苗，因此亟需研制出安全有效且治疗机制明确的药物。中药以及中成药在临床上表现出较好的抗病毒活性[6]，但抗EV 71的研究主要集中在体外细胞学实验，动物体内实验相对较少[7]。馥感啉口服液由鬼针草、野菊花、西洋参、黄芪、板蓝根、香菇、浙贝母、麻黄、前胡、甘草等组成，具有清热解毒、止咳平喘、益气疏表之功效，用于小儿病毒感染疗效确切。本实验旨在评价馥感啉口服液在小鼠体内对EV 71的治疗效果，为临床用药提供实验和理论基础。

1材料与方法

1.1　材料

1.1.1实验药物：馥感啉口服液 (规格：10 mL/支)，含生药10 g, 由广州一品红制药有限公司生产，国药准字Z20025275, 生产批号110703; 0.9%氯化钠注射液 (规格: 500 mL), 4.5 g, 由石家庄四药有限公司，生产批号121030408。根据《中药、天然药物急性毒性试验技术指导原则》的具体要求，计算馥感啉口服液的最低有毒剂量为20 g/kg, 由此设计实验药物浓度为高剂量: 20 g/kg; 中剂量: 10 g/kg、低剂量: 5 g/kg，均采用0.9%生理盐水稀释。

1.1.2病毒株: C4亚型EV 71病毒小鼠适应株，滴度为107TCID50/mL, 由中国医学科学院医学实验动物研究所保存并提供。

1.1.3实验动物: SPF级ICR孕鼠12只，各带乳鼠7只，乳鼠雌雄不限，另外4窝孕鼠备用，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2009-0007。12窝乳鼠分为4组，分别为对照组、高剂量组、中剂量组和低剂量组各3窝，每窝7只，每组共21只。

1.2　方法

病毒原液用生理盐水稀释10倍，在乳鼠10日龄时，采用腹腔注射方法感染小鼠，每只0.1 mL。2 h后，高、中、低剂量组分别给予20 g/kg、10 g/kg和5 g/kg浓度药物，给药体积均为0.2 mL, 对照组给予等体积的生理盐水，连续给药6 d。观察动物的外观(动物皮肤毛发、眼和黏膜的变化)、行为(呼吸、中枢神经系统、四肢活动及其他表现)、分泌物和排泄物等。给药后密切观察动物至少2 h，如果出现异常症状，详细记录症状以及症状起始的时间、严重程度、持续时间等，以后每天至少观察2次，同时观察动物存活情况，详细记录死亡数量。

2结果

2.1　实验动物生存情况

各组小鼠在感染后第2～3天均出现弓背竖毛等症状，感染后第4天出现不同程度的后肢衰弱、单侧或双侧后肢瘫痪，同时眼部出现分泌物。高剂量组动物出现褐色样稀便，腹泻物分布在肛门周围和被毛。在感染后第4天，对照组和低剂量组动物开始出现死亡，第5天高剂量组和中剂量组动物也开始出现死亡，对照组动物死亡高峰集中在第5～11天。在感染第11天后，各给药组动物的腹泻、眼部分泌物等临床症状有不同程度的缓解和恢复，个别后肢瘫痪的动物症状开始缓解或由双侧恢复为单侧，试验结束时部分动物运动功能恢复正常。

低、中、高剂量组和对照组小鼠生存率分别为57.1%(12/21)、52.4%(11/21)、47.6%(10/21)和19.0%(4/21), 经Kaplan-Meier曲线分析生存情况显示差异有统计学意义(χ2=8.369,P=0.039), 进一步组间两两比较表明，各给药组生存率均高于对照组(P<0.05), 而不同剂量组间比较无明显差异(P>0.05)。低、中、高剂量组死亡保护率分别为47.1%、41.2%、35.3%。

2.2　实验动物体质量变化

在感染给药的前5 d内动物平均体质量没有明显的变化，在第6天时高剂量组动物体质量值略有下降，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。各给药组动物在第10天起体质量开始缓慢增加，组间比较差异仍无统计学意义(P>0.05)。

3讨论

引发手足口病的病原体多达20多种，其中最常见的为柯萨奇病毒A16型(Cox A16)和EV 71。因EV 71感染病程长、体温峰值高、容易累及神经系统，且预后比Cox A16更为严重而备受关注[8-9]。流行病学显示，2011年全年确诊病例中，EV 71约占50%，且每月确诊病例中均以EV 71为主[10]。目前针对EV 71的基础研究尚处于初级阶段，由于缺乏合适又经济的动物模型，药物筛选和评价工作的进展缓慢。国外和台湾某些研究中使用低于7日龄的乳鼠建立动物模型，虽然这类模型对EV 71较为敏感，但由于其免疫系统发育尚未成熟，不能正确模拟人体生理状态，在应用中受到很大限制[11]。7～10日龄乳鼠是目前作为研究EV 71相对合适的动物模型，既保持了对病毒的敏感度，又能有效模拟人类致死性中枢神经系统并发症[12]。本实验采用10日龄的乳鼠作为评价馥感啉口服液抗EV 71药效的动物模型，各组实验动物均出现典型的病理表现，如体质量下降、精神萎靡、竖毛弓背等，说明动物模型感染病毒成功。

前期细胞学研究证实馥感啉口服液在体外对侵染细胞的EV 71具有抑制作用，本实验进一步探索馥感啉口服液对感染EV 71小鼠的药效和剂量筛查，结果显示各剂量药物对模型小鼠的治疗效果均优于对照组，其中以低剂量组的死亡保护率较高(47.1%)，而低、中剂量组的疗效要优于高剂量组。此类问题在多种中药复方制剂中都有出现，原因可能是中药复方制剂由于成分多样，配伍的药物之间相互作用机制比较复杂，药物中的辅药由于剂量变化而引起作用改变。

馥感啉口服液分别对接种H1N1和H3N2的细胞具有直接杀伤和抑制增殖的作用，对呼吸道合胞病毒也有明显的体外抑制效果[13]。临床上亦表明，该制剂治疗小儿疱疹性口炎的总体有效率为89.1%、治疗病毒性肺炎的有效率为94%，治疗效果优于其他同类品种[14]。中药复方多靶点是其抗病毒作用的重要优势，除了直接杀伤病毒，馥感啉口服液还可通过提高免疫力增强吞噬功能，改善因病毒感染导致的免疫功能紊乱状态。针对免疫力低下的反复呼吸道感染患儿，馥感啉口服液的有效率为92.9%，并且可从根本上改善机体的免疫状态，提高小儿预防流感的能力[15]。有研究证实，EV 71感染所致的HFMD患儿体内存在免疫紊乱，体内T细胞亚群和免疫球蛋白均低于正常同龄儿童，且病情越严重，免疫功能越，虽然尚不能证明这种免疫异常是致病原因还是病毒感染的结果，但适当的免疫功能调节必须而且有效。

参考文献

[1]Fang Y, Wang S, Zhang L, et al. Risk factors of severe hand, foot and mouth disease: a meta-analysis[J]. Scand J Infect Dis, 2014, 46(7): 515.

[2]Wang S M, Liu C C. Update of enterovirus 71 infection: epidemiology, pathogenesis and vaccine[J]. Expert Rev Anti Infect Ther, 2014, 12(4): 447.

[3]Wang Q, Zhang W, Zhang Y, et al. Clinical features of severe cases of hand, foot and mouth disease with EV 71 virus infection in China[J]. Arch Med Sci, 2014, 10(3): 510.

[4]中华人民共和国卫生部. 手足口病诊疗指南(2010年版)[J]. 国际呼吸杂志, 2010, 30(24): 1473.

[5]Li R, Liu L, Mo Z, et al. An inactivated enterovirus 71 vaccine in healthy children[J]. N Engl J Med, 2014, 370(9): 829.

[6]Pu X, Wang H, Li Y, et al. Antiviral activity of GuiQi polysaccharides against enterovirus 71 in vitro[J]. Virol Sin, 2013, 28(6): 352.

[7]Wang H Q, Meng S, Li Z R, et al. The antiviral effect of 7-hydroxyisoflavone against Enterovirus 71 in vitro[J]. J Asian Nat Prod Res, 2013, 15(4): 382.

[8]李玉芬, 孙绍霞, 李志方, 等. 儿童肠道病毒71型所致手足口病的神经系统临床特征[J]. 临床儿科杂志, 2010, 28(11): 1011.

[9]谢国锦, 谢芳艺, 张国锋, 等. 人肠道病毒71型和科萨奇病毒A组16型所致手足口病的主要临床表现和预后[J]. 南京医科大学学报：自然科学版, 2011, 31(10): 1436.

[10]靳妍, 张静, 孙军玲, 等. 2011年中国大陆手足口病流行特征分析[J]. 疾病监测, 2012, 27(9): 676.

[11]Fujii K, Nagata N, Sato Y, et al. Transgenic mouse model for the study of enterovirus 71 neuropathogenesis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(36): 14753.

[12]马春梅, 刘江宁. C4亚型人肠道病毒71型的小鼠肌肉适应株对小鼠具有致死毒力[J]. 中国比较医学杂志, 2012, 22(5): 31.

[13]覃筱燕, 张淑萍, 杨林, 等. 馥感啉口服液的药效作用的实验研究[J]. 中央民族大学学报: 自然科学版, 2004, 13(3): 217.

[14]邢丽辉, 朴春姬, 吴军. 中药馥感啉口服液雾化吸入结合西药治疗婴幼儿病毒性肺炎65例[J]. 中国社区医师: 综合版, 2005, 7(20): 32.

[15]胡小平, 陈杰. 手足口病并发脑炎患儿免疫功能及与病情严重程度的关系研究[J]. 儿科药学杂志, 2014, 20(3): 7.

通信作者:高虹, Email: gaohongdws@aliyun.com

收稿日期:2014-12-15

中图分类号:R 373.2

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)05-108-02DOI: 10.7619/jcmp.201505036