免疫抑制剂的治疗药物监测概况及研究进展

付鹏（天津市第一中心医院药学部，天津 300192）

随着临床治疗中器官移植技术的发展和广泛应用，免疫抑制剂的应用受到越来越多的关注。免疫抑制剂通过抑制淋巴细胞的功能，减少移植物排斥反应的发生，延长移植物存活时间。但由于免疫抑制剂具有较强的毒性，尤其是肾毒性，因此，常常需要在低剂量发生移植物排斥和高剂量产生毒性之间取得平衡。除了经典的细胞毒药物如肾上腺皮质激素、环磷酰胺、硫唑嘌呤等外，新一代免疫抑制剂如环孢素A（CsA）、霉酚酸脂（MMF）、他克莫司（FK506）、西罗莫司等，由于其治疗窗窄（即治疗浓度与中毒浓度接近），其药代动力学存在明显的个体内及个体之间的差异，因此需要密切监测药物浓度，以确保药物处于安全有效的治疗范围，且不易中毒。

治疗药物监测（TDM）是在药代动力学原理的指导下应用现代先进的分析技术，测定血液中或其他体液中的药物浓度，用于设计或调整给药方案，以提高药物的疗效和减少不良反应的发生。国外也将其称为临床药代动力学监测（CPM）。本文将对国内外TDM进展进行回顾，总结治疗药物监测的当今概况和探讨未来发展趋势。

1 目前临床常进行TDM的药物种类

TDM是建立在血药浓度与药理效应之间存在一定关系的基础上，在临床上，并不是所有药物或在所有的情况下都需要进行TDM。目前临床常进行TDM的药物种类有：

1.1 强心苷类：地高辛、洋地黄毒苷。这类药物因有效浓度范围小，易过量中毒而需要监测。

1.2 抗心律失常药：利多卡因、普鲁卡因胺、奎尼丁、胺碘酮、因卡胺、异丙吡胺等。

1.3 β-受体阻断剂：普萘洛尔、美托洛尔、阿替洛尔。

1.4 抗癫痫药［1］：苯妥卡因、苯巴比妥、乙琥胺、卡马西平、丙戊酸钠、拉莫三嗪、托吡酯、非氨酯、加巴贲丁、氨已烯酸、唑泥沙胺、奥卡西平、泰加平、左乙拉西坦，这类药物因个体差异大、药物相互作用、长期用药，而需要监测。

1.5 抗精神病药［2-3］：对于经典的抗精神病药，进行TDM是为了控制药物依赖性和避免锥体外系不良反应；对于非典型抗精神病药，如氯氮平，用药安全是其受监测的原因。临床上应用的一些新型抗精神病药，如利哌酮、奥氮平、喹硫平、氨磺必利、齐拉西酮、阿立哌唑，其TDM 的应用原理仍处于争论之中。Hiemke等［2］实验证明，在使用新型抗精神病药时进行TDM有利于提高药物有效性和安全性。

1.6 平喘药：氨茶碱。

1.7 抗抑郁药［4］：丙咪嗪、阿米替林、去甲替林。

1.8 抗躁狂症药：碳酸锂［5］等。随着先进设备的广泛普及，含锂化合物的TDM 被更加频繁地应用。国内由于仪器缺乏，使碳酸锂等药物的应用受到限制。

1.9 解热镇痛药。

1.10 抗菌药物：主要是氨基糖苷类，如庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、链霉素，易出现耳毒性；其他抗菌药物，如万古霉素、去甲万古霉素和两性霉素B。

1.11 抗病毒药［6］：抗人体免疫缺陷病毒（HIV），抗艾滋病药物向来是研究的热点。

1.12 抗肿瘤药［7-8］：甲氨蝶呤、顺铂［9］，这类药物都是细胞毒性药物，因此需要监测。

1.13 免疫抑制剂：免疫抑制剂的研究一直是热点问题［10］。随着全球性器官移植的迅速发展，临床医生也认识到免疫抑制剂的治疗窗窄问题，若想发挥其既不发生排斥又安全有效的理想作用，仅仅依靠经验疗法是无法达到的，必须开展TDM。临床常见的需要进行TDM的免疫抑制剂主要包括：CsA［11］，FK506，西罗莫司和 MMF［12-13］。

1.14 利尿药。

1.15 抗真菌药：伊曲康唑、酮康唑等。伊曲康唑［14］影响复杂，是CYP3A4 的底物和诱导剂，还是P-糖蛋白转运系统的底物和诱导剂，容易与多种药物发生相互作用。

2 TDM常用分析方法

2.1 分光光度法［15］：早在20世纪50年代末，紫外分光光度（UV）法已用于临床监测血药浓度，该法是国内最早用于临床测定苯巴比妥和苯妥英钠血药浓度的方法。这种方法需要样品量大、 灵敏度低、干扰因素多、专属性不好，因此不能普及使用。但由于它简便、易行、稳定、价廉，在条件较差的地区仍有使用价值，国外有的实验室至今还使用此方法监测苯巴比妥血药浓度。UV法可用于测定茶碱血清浓度［16］，且其准确性不比荧光偏振免疫分析法（FPIA）低［17］。

2.2 色谱法（单用或与质谱联用）：色谱分析法包括气相色谱法（GC）和高效液相色谱法（HPLC）。20世纪70年代初，Gallagher等建立了GC并用于临床监测PB、PHT、PRM血药浓度。色谱法灵敏度高、选择性强，可同时测定多种药物及其代谢产物，Dickinson等［18］建立了同时测定安泼那韦、利托那韦等7种抗艾滋病药物的方法学。色谱法不仅适用于常规监测，还适用于新药的研究。其不足之处在于测定周期长，测定分析技术较难于掌握。

2.2.1 高效液相色谱法：HPLC的分离机制包括正相、反相、离子交换、体积排阻，其中反相色谱（RP-HPLC）分离测定效果明显优于其他各类而被广泛用于TDM中。大多数药物（极性、非极性、离子型）均可被RP-HPLC分离测定。另外一些特殊固定相，有的可分离对映体，有的可用于生物体液直接进样。与GC相比，HPLC能提供更多的便利，分析速度快，应用范围广，它可用于分离极性、非极性、热稳定性差的化合物，可测定大部分药物。Streit等［19］建立了一种快速、灵敏、可靠的液相色谱质谱分析（LC-MS）方法，用于测定游离或全血中的霉酚酸浓度，从而研究有活性的游离药物与药效/毒性的关系，并应用于临床TDM中。

2.2.2 气相色谱法：特点是取样量小、灵敏度高、可同时分析数种药物和代谢产物。但样品的前处理复杂，需要提取并制成易挥发的物质，不适合分析不耐高温的药物。气相色谱和质谱联用（GC-MS）具有更高的专一性和灵敏度，是目前应用的热点。

2.3 免疫学方法：免疫分析法的原理是被分析药物（D）和标记后的该药物（D*）与特异性抗体竞争有限的结合部位，患者血样中未标记药物的浓度取决于标记药物与特异性抗体结合的量。标记物可能是放射性同位素、酶、荧光或化学发光物质，依据标记物的属性，可分为以下几种方法：

2.3.1 放射免疫法（RIA）：RIA是非常灵敏的分析方法，但费时费钱，需使用放射性物质和专门的计数器，且其应用范围有限，RIA试剂盒仅可监测几种药物（地高辛、环孢素等），其放射性废料需要保存很长时间才能失活。因此，RIA逐步被非同位素标记的均相免疫分析法取代，这些方法所使用的标记物是酶或荧光分子化合物。

2.3.2 均相酶免疫法（EMIT）：原理是测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的吸收度，即基质（为葡萄糖-6-磷酸）和辅酶〔为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）〕之间的反应。Weber等［20］在一项儿童肾移植的MMF治疗中分别使用了EMIT与HPLC，并进行了活性成分霉酚酸的测定。结果显示EMIT较HPLC更有利于诊断，但由于抗体与代谢物产生交叉反应，EMIT的限定值比HPLC的高。

2.3.3 荧光偏振免疫法（FPIA）：原理是测定能发射荧光的酶反应后荧光强度。FPIA不是运用酶反应而是测定偏振荧光的强度，偏振荧光产生于标记药物与特异性抗体的结合，荧光素通常作为荧光标记物。

2.3.4 微粒子酶免疫法（MEIA）：原理是将包被了抗体的微粒子试剂与待测标本混合，加入碱性磷酸酶标记的抗体，经温育后形成固相包被抗体-抗原-酶标记抗体复合物，再将复合物转移到玻璃纤维柱上，用缓冲液洗去没有结合的抗原和酶标记抗体，结合了抗原抗体的微粒子留在了玻璃纤维柱上。此时再加入反应底物4-甲基酮磷酸盐（4-Mup），4-Mup被酶标抗体上的碱性磷酸酶分解成甲基酮，它在360 nm激发光的照射下，发出448 nm的荧光，经过荧光读数仪的记录、放大，最后由电脑计算出所测物质的含量。

2.3.5 化学发光微粒子免疫法（CMIA）：原理是将包被了抗体的微粒子试剂与待测标本混合，经温育后，将反应杯送到冲洗站，利用磁场吸附磁珠，加入洗液进行洗涤，洗去未结合的抗原抗体复合物，再加入标记有4-吖啶酯的抗原，这样就形成抗原-抗体-抗原-4-吖啶酯复合物。用同样的方法洗去未结合的物质后，加入预激发液（过氧化氢）进行连续的本底测定；再加入激发液（高pH溶液），将发光物质4-吖啶酯从复合物上切下来，游离到溶液中，在激发光的照射下发出荧光，通过检测溶液中的发光强度，可以判断标本中药物的浓度含量，标本中药物含量越多，标记有4-吖啶酯结合的复合物就越多，荧光强度就越强。

免疫抑制剂临床常用的监测方法主要是色谱法和免疫分析法，使用免疫法具有分析周期短，自动化程度高，操作简单，适用于急诊和大量样本测定等特点，发达国家实验室大多采用此法。其缺点在于抗体与药物代谢产物存在交叉反应，代谢物会干扰药物的测定，测定范围限于常规品种，不能满足对新药进行研究的要求，仪器和试剂盒依赖进口，价格昂贵。但由于药物活性代谢产物对药效的产生有一定贡献，因此，当使用免疫法对免疫抑制剂进行TDM时，活性代谢产物与抗体发生交叉反应反而更能真实地反映药效水平。

2.4 毛细管电泳法（HPCE）：特点是高效分离、自动化、操作简单、样品量少、精确度高、分析速度快、不需要有机溶媒而仅需缓冲溶液、所用材料成本低廉。Shihabi等［21］在含有十二烷基硫酸钠的硼酸盐缓冲液中用该法测量新抗癫痫药keppra血药浓度，血浆无需特别处理，整个过程简单快速，优于HPLC。

2.5 原子吸收法：操作简单，可测定含有金属离子的药物。如顺铂、碳酸锂。

3 药物遗传学、药物基因组学与药物治疗研究的联系是新热点

药物遗传学监测，即个体遗传多态性的筛选可通过表型分型或基因分型来进行。

药物代谢酶多态性表型分型是通过检测个体的代谢能力来间接分析遗传性差异的一种方法。它运用药物探针测定其代谢产物，从生化水平来衡量个体间药物遗传学差异，从而对个体进行慢代谢者、中间代谢者、快代谢者或极快代谢者的分类。

基因分型则是通过检测个体DNA直接分析遗传性差异的一种方法，比表型分型损伤性小，可避免药物所带来的潜在不良反应。药物反应的遗传变异是机体分子水平改变的结果，例如在药物代谢酶、药物受体和药物转运蛋白水平上的基因缺失、单核苷酸多态性（SNP）或基因拷贝重复等。目前，大多数遗传药理学研究集中在基因变异对药物代谢酶表达与功能影响等方面，而对药物受体和药物转运蛋白的遗传药理学研究还比较少。

3.1 药物代谢酶［22］：关于药物代谢酶的遗传多态性已有很多报道，其中对细胞色素氧化酶（CYP）亚型的研究最为深入。在多态性表达的CYP中，由CYP2D6、CYP2C19和CYP2C9代谢的药物占临床用药的相当一部分，相对较为重要。CYP2C19为代谢S-美芬妥英的氧化酶，该基因缺陷的患者对于一些药物如甲妥英、环己烯巴比妥等高度敏感，其第5外显子上单个碱基的突变（A→G）就可以导致功能丧失。CYP2D6仅占肝脏总CYP的1%～2%，但已知多达80余种药物经其催化代谢，个体活性差异最大，可达1 000倍。CYP3A4是人体内介导的数量最多的药物代谢酶，尚未发现它有完全失活的突变，但有报道显示其启动子可能存在多态性。另外还有N-乙酰转移酶（NAT）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）、硫嘌呤甲基转移酶（TPMT）等Ⅱ相转移酶，其显著的多态性对预测药物不良反应、指导临床用药及疾病易感性均有重要意义。

3.2 药物转运蛋白：药物转运蛋白P-糖蛋白（P-gP）的多态性已有报道［23］，然而其临床意义有待阐明。P-gP的作用首先在肿瘤细胞中发现，它作为ATP依赖的流出泵用于预防细胞内肿瘤化疗药物的积累。现在普遍认为，肿瘤细胞内P2糖蛋白的过量表达是结构不同的细胞毒药物获得性抗药性的主要机制（又称多药抗药性，MDR）［24］。P-gP在正常组织中也有一定的表达水平，对药物吸收、肾脏和肝脏药物排泄以及血-脑屏障药物穿透性等方面具有重要作用。Owen等［25］报道了P-gP在HIV治疗上的两种相对作用，编码P-gP的基因ABCB1多态性对HIV的治疗作用符合期望，一些研究又认为抗逆转录病毒药物是P-gP的诱导剂，这启示我们将来在P-gP用于HIV的研究中，要同时考虑药理和病变组织的共同影响。

CsA与FK506均为临床常用的实体器官移植的钙调磷酸酶抑制剂，它们主要通过肝脏和小肠细胞色素 P450 3A4（CYP3A4）、CYP3A5、CYP3A7、CYP3A4代谢，同时又都是 P-gP的底物［26-27］，CsA和FK506分别与各自作用靶点结合后才能发挥其免疫抑制作用。这两种药物具有治疗窗窄、个体间药代动力学差异大的特点，临床上一般通过监测血药浓度，反复调整，最终确定药物剂量的方式来克服。但是因急性器官排斥反应大多发生在器官移植后5天左右，而通常术后5天CsA和FK506的药物浓度达到稳态，才开始首次药物浓度监测，这时再根据血药浓度监测结果调整剂量，会有通常50%以上的器官移植患者达不到或超过理想的靶血浓度。药物基因组学研究指示：不同个体间药物代谢酶、药物作用靶点和药物转运体活性差异可能是造成不同器官移植患者钙调磷酸酶抑制剂药代动力学（PK）差异的主要原因，而编码这些蛋白基因序列变异可能是其产生活性差异的分子机制。临床研究表明［28］，CYP3A4、CYP3A5和MDR1（编码P-gP的基因）的基因多态性可能是造成CsA和FK506个体间存在PK差异的主要原因。

CYP3A在肝微粒体P450中含量最多，占总量的一半以上，参与约60%的临床药物代谢。CYP3A5是CYP3A家族重要成员之一，它的表达与活性呈高度多态性，存在广泛的个体及种族间差异［29］。其中 CYP3A5*3（A6986G，intron3）基因型较常见，在中国肾移植患者中的突变频率高达75.4%。该基因型能产生数种剪接变异体mRNA使终止密码子提前，导致CYP3A5酶活性严重降低或缺失。CYP3A5是参与FK506代谢的主要催化酶之一，对FK506代谢的贡献率达60%。临床研究显示［30］：CYP3A5*3基因型会使其酶活性显著下降，药物口服清除率降低，从而极大地影响了FK506的血药浓度；携带*3基因型的肝移植患者使用FK506后血药浓度明显高于野生型患者，因此，鉴定患者是否携带CYP3A5*3基因型，可以协助临床医生确定安全有效的FK506剂量。

药物基因组学是近些年发展起来的研究基因多态性与药物多样性相互关系的学科，它在整个基因组水平上进行研究，全面衡量酶、受体、离子通道等影响药物疗效和不良反应的综合效应。

随着对药物代谢酶、药物受体和药物转运蛋白，不同个体间DNA序列存在遗传差异，不同基因编码不同的作用点等方面的深入了解，任何一个药物在人体代谢过程中都存在着个体差异［31］，这有利于改变传统“一个处方人人适用”的观点。做到“量体裁衣”，根据基因的特性为群体甚至个体设计合适的给药方案，可以提高药物作用的有效性、安全性和经济性。

4 免疫抑制剂TDM的未来可能的监测模式

TDM应向药物活性代谢物、游离药物、对映体监测等项目发展，从而有利于解释血药浓度与药效不平行的现象，解释和预防某些药物的不良反应，指导临床合理用药。目前，几乎所有的血药浓度监测和药代动力学研究都是通过测定血浆或血清中药物的总浓度进行的。这是因为在一般情况下药物在治疗浓度范围内的血浆蛋白结合率较为恒定，血药总浓度水平基本上可以反映游离药物浓度。然而通过多年工作实践发现，许多因素可影响药物的血浆蛋白结合率，从而使血药总浓度并不能反映游离药物水平。此时如果还用血药总浓度指导临床用药，将会导致错误的结论，使治疗失败，甚至导致严重的后果。因此，游离药物监测越来越受到人们的关注和重视，并已成为治疗药物监测研究的热点之一。未来这一方法可在制定个体化的给药方案、获得最佳疗效和减少不良反应等方面发挥重要作用。

在未来，TDM 将最大可能地在选定的患者中联合传统模式和药物遗传学监测一起进行［32］。除了像传统的TDM那样监测患者药物浓度是否在治疗范围之内以外，我们更有可能前瞻性地用患者特异性遗传信息来监测药物治疗。患者的遗传信息将以基因芯片的形式储存和调用，使得根据每个人特定的代谢、消除等基因型来选择药物和决定其剂量成为可能。

将来临床药物治疗模式应以遗传药理为导向，结合血药浓度监测指导特定药物在特定患者上的合理使用。随着进入个体化药物治疗时代，我们不仅需要对某一特殊的患者给予最好的药物，而且还应在治疗的初期就给予最有效和最安全的药物剂量［33］。