太湖地区与皖南地区中华蜜蜂微卫星DNA遗传多样性分析

吉挺 沈芳 孟祥金 王帅 李文明

摘要：利用筛选后的2对荧光标记微卫星引物，研究太湖地区与皖南山区中华蜜蜂（以下简称中蜂）间的遗传多样性并分析其遗传分化。研究检测判定了60个中蜂个体的基因型，计算2个群体的优势等位基因频率（i）、期望杂合度（He）、多态信息含量（IC）、群体内近交系数（Fis），并分析中蜂群体内与群体间的遗传变异，采取配对试验均数差异t检验比较太湖中蜂与皖南中蜂群体的遗传差异。结果表明，太湖地区与皖南山区2个中蜂群体间的i、He、IC、Fis差异均不显著（i=0356>005，He=039>005，IC=0260>005，Fis=0428>005）。可见，太湖地区与皖南地区两地中蜂群体存在一定的遗传多样性，但遗传分化程度不大。本研究结果对江苏与安徽两地中华蜜蜂品种的选育和保护也具有一定的指导意义。

关键词：太湖地区；皖南地区；中华蜜蜂；微卫星DNA标记；遗传多样性

中图分类号： S898文献标志码： A[HK]

文章编号：002-302（204）2-002-05

中华蜜蜂（Apis cerana cerana）简称中蜂，指分布于我国境内东方蜜蜂地理亚种的总称，是我国特有的遗传资源，家养历史悠久，2006年被列入国家畜禽保护名录中。江苏省自古是我国野生中蜂的聚居区，也是最早引入新法饲养的地区之一[2]。近几十年来，由于西方蜜蜂大量引入及自然条件的破坏，江苏省中蜂遗传资源已消失迨尽，目前仅在环太湖地区略有分布，种质资源保护迫在眉睫[3]。同时，随着近几年环太湖地区设施农业的快速发展，蜜蜂授粉尤其是中蜂授粉的需求越来越多，现有的中蜂资源已不能满足农业生产的需求。皖南地区地形复杂，植被丰富，适宜中蜂栖息，中蜂资源十分丰富[4]，而且皖南地区与太湖地区相隔较近，没有任何地理隔离，所以从皖南地区引入蜂群可能是解决太湖地区中蜂资源缺乏的有效方法。但是引入后是否会改变太湖地区原有中蜂的遗传结构，继而对当地种质资源保护造成负面影响是应该考虑的首要问题，所以需要对2个地区现有中蜂资源的遗传结构与遗传多样性进行比较分析。

微卫星是目前普遍使用的分子遗传标记，具有多态性好、共显性、易于鉴定、检测重复性好、在基因组分布广泛等优点。联合国粮农组织（FAO）在其持续发展和管理动物遗传资源的战略计划中，推荐将微卫星标记作为优先考虑的分析工具[5-6]。近几年来，微卫星标记已广泛应用于我国各地蜜蜂种质资源的分析中，但是目前普遍采用聚丙烯酰胺电泳加放射显影或银染的方法，不仅费时费力效率低，而且误差较大[7-9]。本研究利用筛选后的2对荧光标记微卫星引物对太湖地区与皖南地区的中蜂进行遗传多样性比较和遗传分化分析，旨在初步评价2个地区中蜂群体遗传结构的差异，继而探讨江苏省太湖地区异地引入蜂群的可能性。

材料与方法

试验材料

太湖地区中蜂（DS）来自于江苏省苏州市吴中区东山镇，皖南山区中蜂（X）来自于安徽省宣城市泾县山区，每个地区各随机选取30群，蜂群尽量以野生种群为主，每群随机采集成年工蜂0只，用无水乙醇溶液浸泡保存。中蜂群体的采集信息见表。

参照吉挺所建立的方法[0]提取中蜂基因组DNA，用微量紫外可见光度计（NanoDrop ND-000）测定其含量与纯度，-20 ℃ 保存备用。

2微卫星引物的筛选及CR条件的优化

根据笔者所在课题组对中华蜜蜂转录组测序结果所获得的3 000多个微卫星位点进行筛选，每条染色体选择2～3对微卫星引物，共初步选取54对微卫星引物，送往上海生工生物工程有限公司合成。根据GenBank和相应文献提供的微卫星引物对所选54对引物进行优化，进一步筛选出 30对扩增效果较好的微卫星引物，具体所选微卫星引物信息见表2。

由于CR反应中影响因素较多，试验分别设计了以DNA模板浓度、Mg2浓度、Taq酶用量、退火温度为因素的梯度试验，最终确定CR的反应体系：0×Buffer 20 μL，25 mmol/L MgCl2 0 μL，0 mmol/L dNTs 05 μL，0 pmol/μL 上游引物 0 μL，0 pmol/μL 下游引物 0 μL，5 U/μL Taq DNA聚

配制3%琼脂糖凝胶，点样6 μL，20 V电泳20 min，检查产物的有无。如有产物，配制8%聚丙烯酰胺凝胶80 mL体系，00 V预电泳5 min，点样0 μL，20 V电泳3 h。进行硝酸银染色，直至出现清晰的等位基因条带。

4荧光引物的筛选和组合

根据聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，尽量选择不同染色体上的标记，淘汰掉无法扩增以及无多态性的引物，最终选出相对较理想的2对多态性较丰富的微卫星引物：7-CL278Contig（）、5-CL4Contig（γ）、39-CL308Contig6（X）、7-CL462Contig5（S）、8-CL470Contig3（T）、37-CL293Contig（W）、29-CL229Contig33（K）、28-CL650Contig3（B）、33-CL360Contig4（L）、-CL229Contig27（M）、4-CL549Contig3（R）、-CL33Contig4（Q）。每对引物的上游 5′ 端分别用荧光染料FAM（蓝色）、HEX（绿色）、TAMRA（黄色）进行标记，获得的荧光标记引物避光保存。按照微卫星引物的碱基长度进行组合，为了便于区分得精确一些，组合的引物长度至少相差 20 bp，获得的5个荧光标记微卫星引物组合信息见表3。

CR荧光产物STR分型送至上海生工生物工程有限公司进行，使用ABI-3730XL DNA Analyzer全自动测序仪检测。上样的总体积为35 μL，其中的上样液Hi-Di Formamide 0 μL、GS-500 Size Standard 05 μL，另外的3 μL为混合CR产物。将Hi-Di Formamide 和GS-500 Size Standard 混合均匀后与等量的同一个体的CR产物进行混合，然后进行个体编号，依次加样到96孔板中，接着变性和检测。检测结束后，使用GeneMapper 40软件自动生成独立的图谱文件，读取片段长度、峰值和峰面积，判断纯合子和杂合子（单峰为纯合子，双峰为杂合子），最后导出Excel数据表格。

6遗传多样性分析公式

6等位基因频率

[Z]i=（2niinijnij2…nijn）/（2N）。

其中：i为第i个等位基因频率；nii为第i个等位基因纯合个数；jn为与i共显的第n个等位基因；nij为含i与jn共显的等位基因个体数；N为群体中个体数。

62杂合度

[Z]He=-∑[DD（]ki=-[DD）]2i。

其中：k为等位基因数；i为第i个等位基因频率。

63多态信息含量

[Z]IC=-∑[DD（]ki=[DD）]2i-∑[DD（]k-i=[DD）]∑[DD（]kj=i[DD）]22i2j=2∑[DD（]k-i=[DD）]∑[DD（]kj=i[DD）]ij（-ij）。

其中：k为等位基因数；i为第i个等位基因频率；j为第j个等位基因频率。

64群体内近交系数

[Z]Fis=（Hs-Ho）/Hs。

其中：Ho为观察杂合度；Hs为平均期望杂合度。

65统计分析

利用Microsatellite-Toolkit软件根据GeneMapper 40软件导出的Excel表格来计算等位基因频率与期望杂合度，根据Botestein等的公式设计、计算群体的多态信息含量，再根据FSTAT程序计算群体内近交系数。

2结果与分析

2DNA提取结果

DNA提取出来以后，将其稀释到00 ng/μL，部分琼脂糖凝胶用紫外透视成像系统检测，其结果如图所示：纯度比较高，无拖尾现象。

[FK（W0][TTtif][FK）]

22荧光产物STR分型结果

使用ABI-3730XL DNA Analyzer全自动测序仪进行检测扫板，得到的部分微卫星引物的扩增结果与STR分型结果见图2。图2所示的是太湖地区中蜂DS0个体在B位点的扩增结果，基因型为32/34（杂合子）；皖南山区中蜂X03个体在T位点的扩增结果，基因型为32/32（纯合子）。

23太湖地区与皖南山区中蜂优势等位基因的比较

由表4可见，利用配对试验均数差异双尾t检验对2个群体优势等位基因频率进行处理，结果i=0356>005，即太湖地区与皖南地区中蜂群体在这2对微卫星引物标记上检测出来的优势等位基因差异不显著。

24群体间相关参数分析

由表5可知，太湖地区中蜂群体的He、IC、Fis平均为055、059、0053，均略高于皖南山区中蜂群体（0473、0423、025）。对2个群体的He、IC、Fis进行t检验，结果显示，2个群体的3个参数差异均不显著（[HT5”]He=039、IC=0260、Fis=0428）。

3结论与讨论

从2006年开始，陆续有研究者利用西方蜜蜂微卫星标记

对我国中蜂遗传资源及遗传多样性进行分析，但普遍方法是在CR扩增后采用聚丙烯酰胺电泳加放射显影或银染的方法，通过人为观察主观地对多态性条带进行分析，这种方法最令人质疑的在于很难将相邻近的2个条带准确区分开来，从而造成判型误差[7-8]。目前利用荧光引物扩增的微卫星位点具有较高的分辨率和灵敏度，对扩增产物在单碱基水平和表达量方面也具有较高的准确性。本试验利用ABI基因测序分析仪对荧光标记DNA片段进行检测，并利用分子量内标对DNA片段长度进行计算，使2个地区的中蜂STR分型方法较传统方法更精确，更能真实反映2个群体内的遗传多样性及群体间的遗传分化。

本研究在笔者所在课题组对中华蜜蜂转录组测序结果所获得的 3 000 多个微卫星位点基础上筛选出2个微卫星位点，尽量保证其在多条染色体或连锁群中都有分布，因此得出的数据有一定的代表性和可比性。群体中频率最高的等位基因是该物种中最原始、最保守的等位基因，其余等位基因是进化[CM（25]过程中由该等位基因突变形成的，因此微卫星的多态性能

2K2]够反映物种的进化历史[2]。本研究发现2个群体的优势等位基因频率间存在差异，但差异不显著（i=0356>005），表明太湖地区中蜂群体（DS）与皖南地区（X）各自维持着一定的种质特性，但两者之间遗传分化较小。这可能与这2个地区相隔距离较近、两者基因流动值较高有关，表明从皖南山区引入部分中蜂蜂群，扩大太湖地区中蜂种群数量，进行蜂蜜生产与授粉，不会对当地中蜂遗传资源产生较大影响。

多态信息含量是衡量基因片段多态性较好的指标，当IC>05时，该座位为高度多态性座位；当025

期望杂合度别称基因多样度，是一个度量群体遗传变异的最适参数[4]。本研究所选用的微卫星标记中，、γ、T、R、Q、X、W等7个标记有较高的多态性，群体遗传多样性丰富，具有较高的选择潜力；而B标记在2个群体间表现出完全不同的多态性，其在皖南山区中蜂群体中为纯合子，而在太湖地区群体中表现为高度多态（He=0875），今后可将其作为候选遗传标记区别2个地理群体。

本研究通过对太湖地区与皖南山区中蜂群体进行遗传多样性检测，对2个群体主要遗传参数进行比较，结果显示，2个群体间的He、IC、Fis差异均不显著，其中太湖地区中蜂群体的He、IC还略高于皖南山区，表明太湖地区中蜂遗传多样性仍较丰富，这可能与太湖地区蜜源植物资源丰富，适宜中蜂生存，同时该地区与种群数量较多的浙北和皖南山区没有明显的地理隔离，造成相互基因流动有一定的关系。这也说明在分析中蜂群体遗传多样性时，种群数量与其拥有的遗传多样性高低没有直接联系。