缩宫素受体在子宫腺肌症肌层平滑肌组织中的表达及与痛经的关系

胡小美，关 铮，李 洁，刘爱军，刘晋红，范军振，李亚里

解放军总医院，北京 1008531妇产科；2病理科

缩宫素受体在子宫腺肌症肌层平滑肌组织中的表达及与痛经的关系

胡小美1，关 铮1，李 洁1，刘爱军2，刘晋红2，范军振2，李亚里1

解放军总医院，北京 1008531妇产科；2病理科

目的探讨子宫腺肌症(adenomyosis，AM)患者子宫肌层平滑肌组织中缩宫素受体(oxytocin receptor，OTR)的表达水平与痛经程度的关联性。方法收集2013年9月- 2014年8月在本院妇科因AM行全子宫切除手术的腺肌症患者50例为腺肌症组，同期因子宫肌瘤行全子宫切除的患者20例为对照组。应用免疫组化染色法(S-P法)检测20例正常子宫肌层、50例子宫腺肌症肌层平滑肌组织中的OTR表达情况。采用光学显微镜及Image Plus Pro 6.0图像分析系统测定OTR水平，并对其差异进行分析。结果AM组子宫肌层平滑肌组织中OTR的表达高于对照组(62 370±34 758 vs 16 082±11 125，P＜0.01)，且表达强度随着痛经程度的加重而增加，差异均有统计学意义。结论OTR在AM患者子宫肌层平滑肌组织中的表达与痛经程度呈正相关，推测患者痛经形式可能为宫缩痛，表明宫缩强度的增加参与了AM疼痛的发病机制。

子宫腺肌症；缩宫素受体；子宫肌层；痛经

子宫腺肌症(adenomyosis，AM)是一类常见的妇科良性疾病，发病机制尚不明确。临床上主要表现为继发性进行性加重的痛经，发生率高达64.8% ～ 77.8%[1]。因此，研究AM患者痛经的发病机制并给予相应的治疗是缓解及消除患者症状的关键。目前已有研究发现，痛经与宫腔内压力的增高及子宫收缩振幅、持续时间、频率的改变有关[2]；同时，另有研究认为，腺肌症发病与子宫肌层收缩过强及收缩障碍相关[3]。子宫收缩不仅受雌孕激素介导，前列腺素、缩宫素、血管加压素及神经递质类如乙酰胆碱等通过相应的受体也能引起子宫收缩[4]。在这些因素中，缩宫素受体(oxytocin receptor，OTR)是一种重要的收缩相关蛋白，可通过增加平滑肌细胞中的Ca+浓度，引起平滑肌收缩。多数研究表明，OTR在子宫腺肌症异位病灶中表达增加，且与痛经程度呈正相关[5-6]。本研究旨在通过比较OTR在腺肌症肌层及正常肌层平滑肌组织中的表达，进一步探讨OTR导致痛经的作用机制，明确腺肌症患者宫缩强度的改变及其与痛经的相关性。

对象和方法

1研究对象 2013年9月- 2014年8月在本院妇科因AM行全子宫切除手术并经病理检查证实为腺肌症的患者50例(合并盆腔内异症、卵巢巧克力囊肿者除外)为腺肌症组；对照组为同期因子宫肌瘤行全子宫切除的患者20例，不伴有痛经症状，并经病理检查证实均无合并子宫腺肌症或内异症。两组患者均未绝经，且月经周期规律、术前3个月内无性激素用药史，无内分泌、免疫和代谢性疾病等。

2痛经程度分级 本研究已得到我院伦理委员会的审查通过许可。入选患者均签署入组知情同意书，且对AM组患者术前行痛经评分调查。根据视觉模拟评分法(visual analogue scale，VAS)，采用中华医学会疼痛学会监制的VAS卡，卡尺一侧附有刻度，以1 cm为间距，两端分别表示无痛(0)和最剧烈的疼痛(10)，另一侧附有与疼痛程度相对应的表情，卡中心有可滑动的游标。患者面对表情面，将游标滑动在痛经时最能代表疼痛程度的部位，医生面对有刻度的一面，记录相应疼痛程度。结合患者对疼痛程度的描述，进行疼痛评估：轻度疼痛1 ～ 4分：虽有疼痛但可忍受，并能正常生活、工作，睡眠不受影响；中度疼痛5 ～ 7分：疼痛明显，不能忍受，睡眠受到干扰，要求使用镇痛药，用药后好转；重度疼痛8 ～ 10分：疼痛剧烈，不能忍受，睡眠受到严重干扰，必须使用镇痛药，用药后疼痛仍不能缓解，可伴有自主神经功能紊乱表现或被动体位。

3标本采集及处理 切除后的全子宫经10%甲醛固定后，选取增厚子宫肌层中不含出血灶的部分，切割成1 cm×1 cm×0.5 cm的标本。常规脱水、石蜡包埋、制成3μm厚切片，行HE染色进一步确诊子宫腺肌症后，另行切片，免疫组化备用；对照组选取同期因子宫肌瘤行全子宫切除的肌层组织。

4OTR水平检测 采用免疫组织化学方法比较各组患者子宫肌层中OTR的表达。兔抗人OTR多克隆抗体由美国Abcam公司提供，PV-6000通用型试剂盒、DAB显色试剂盒及封闭用羊血清均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。将石蜡切片常规脱蜡至水，高压锅中0.01 mol/L、pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液抗原修复，行羊血清封闭，滴加一抗兔抗人OTR多克隆抗体(1∶20)，置于湿盒内4℃过夜；按照PV-6000二步法免疫组化检测试剂盒说明添加二抗孵育；DAB显色、苏木精复染、脱水透明、中性树胶封片。用心肌组织作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。每张切片随机采取5个不包含腺上皮细胞的肌层视野(×200)，采用显微成像系统(Olympus BX50)拍摄照片，然后利用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对图片进行分析，分别测量各张切片5个视野的累积光密度值(integral optical density，IOD)，计算各视野的平均值，用表示，用于半定量分析。

5统计学处理 临床资料采用t检验。图像分析系统所得数据结果经Excel数据库整理，采用SPSS16.0统计分析软件进行处理，数据以表示。各组均数比较先进行方差齐性检验，表达强度用等级资料，疼痛组与对照组用两样本秩和检验，子宫腺肌症无、轻、中、重度疼痛组与对照组间用多样本两两比较秩和检验；相关关系采用Spearman等级相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1一般情况 AM组年龄34 ～ 56(45±5)岁，对照组年龄33 ～ 51(44±6)岁。两组患者年龄、孕产次、体质量指数、月经周期情况及盆腔手术次数比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。入选50例腺肌症患者中，痛经40例，其中重度痛经20例，VAS分数9.425±0.568；中度痛经10例，VAS分数6.429±0.535；轻度痛经10例，VAS分数3.400±0.516。

2两组子宫肌层中OTR的表达 AM组及对照组均可见OTR的表达，阳性细胞棕黄色颗粒位于细胞质中(图1)。AM组中OTR的表达明显高于对照组肌层中的表达(P＜0.01)。见表1。

图 1 OTR在子宫腺肌症肌层和正常子宫肌层中的表达 A：OTR在子宫腺肌症肌层中的表达(免疫组化，×200)； B：OTR在正常子宫肌层中的表达(免疫组化，×200)； C：子宫腺肌症病灶(免疫组化，×200)； D：子宫腺肌症病灶(HE染色，×40)Fig. 1 Expression of OTR in myometrium between AM patients and controls A: OTR expression in AM group (Immunohistochemical image, ×200); B: OTR expression in control group (Immunohistochemical image, ×200); C: ectopic endometrium in AM group (Immunohistochemical image, ×200); D: ectopic endometrium in AM group (HE staining, ×40)

表1 OTR蛋白在子宫腺肌症肌层和正常子宫肌层中的表达Tab.1 Expression of OTR in myometrium between AMpatients and controls (IOD,±s)

表1 OTR蛋白在子宫腺肌症肌层和正常子宫肌层中的表达Tab.1 Expression of OTR in myometrium between AMpatients and controls (IOD,±s)

GroupCases (n)IOD±s)P (vs control) Control2016 082±11 125 AM5062 370±34 758＜0.01 Serious2090 545±33 013abc＜0.01 Moderate1068 358±15 750ab＜0.01 Mild1039 823±9 507a＜0.01 No pain1023 003±9 853＜0.01aP＜0.01, vs no pain group;bP＜0.01, vs mild group;cP＜0.05, vs moderate group

3OTR的表达水平与痛经的相关性 随着痛经程度的增加，OTR的表达有显著增高趋势(P＜0.01)，而无痛经组与对照组比较，差异无统计学意义。经相关分析，OTR的表达与痛经程度明显相关(r=0.860 9，P＜0.01)。

讨 论

近年来，子宫腺肌症的发病率不断提高，其主要症状继发性痛经已严重影响妇女的工作和生活。目前研究认为，AM所致痛经的发病机制有以下几种可能：子宫平滑肌异常收缩引起的痉挛性疼痛；局部炎症介质、细胞因子等异常增多，刺激神经纤维痛觉传导过度以及腺肌症病灶小囊腔周期性出血至子宫平滑肌张力增大、宫内压升高引起的高张性疼痛。其中子宫平滑肌收缩引起的疼痛已由分娩时的宫缩痛证明。正常情况下子宫平滑肌会在月经周期的不同时段出现方向不同的子宫收缩蠕动波，而正常的子宫蠕动有利于排卵期精子和受精卵的输送以及月经期内膜脱落并及时随血液排出[7-9]。但其蠕动过强则可能出现病理变化，引起患者出现宫缩痛。那么，AM痛经患者是否也存在异常的平滑肌收缩？

OTR是一种典型的G蛋白偶联受体，在正常的子宫内膜层及肌层中均有表达。在子宫内膜腺上皮细胞中，OT通过与OTR结合，诱导内膜上皮细胞产生PGF2α，PGF2α是伤害感受器及疼痛介质的共激活剂，可通过自分泌或旁分泌的形式促进PGE2及自身的分泌[10]，且两者均可上调COX-2的表达[11]，而COX-2又可进一步促进PGE2的高表达，导致痛经[4]。已有研究表明，子宫腺肌症异位内膜腺上皮中，OTR呈高表达，且伴随痛经程度的增加，OTR的表达有增高趋势，由此推断OTR高表达参与了腺肌症痛经的发病机制，猜测与痛经程度相关[6,12]。而在子宫肌层中，OT/OTR可能参与了子宫收缩的调节机制，体现在OT作用于平滑肌细胞中的OTR，升高细胞内Ca2+浓度，直接刺激平滑肌收缩。那么在腺肌症病灶周围的肌层中有无OTR的高表达，从而导致子宫肌层的收缩增强？

本研究通过免疫组织化学方法测定不同痛经程度的腺肌症患者肌层组织中缩宫素受体的表达，探讨腺肌症子宫有无宫缩强度的改变。结果表明，OTR在腺肌症组、对照组肌层组织中均有表达，且腺肌症组明显高于对照组，差异有统计学意义。此外，通过比较OTR在不同痛经程度组肌层中的表达发现，OTR在重度痛经组积分光密度最高，而在无痛经组及对照组较低，具有显著统计学差异(P＜0.01)；通过与对照组比较，无痛经组OTR表达积分光密度值高于对照组，但无统计学差异。由此推断，非痛经者OTR表达相对较低，无宫缩痛；而随着痛经程度加重，宫缩强度增加，表现为明显宫缩痛。腺肌症患者子宫肌层中OTR表达增高，且与患者疼痛的程度明显相关，推测子宫腺肌症患者痛经发病机制与宫缩强度增加有关。该结论在其他研究报道中也有提及，Guo等[4]通过Western-Blot方法测定AM痛经患者平滑肌细胞中OTR呈高表达。

综上所述，OTR在腺肌症痛经患者子宫肌层中的表达明显高于非痛经组及对照组，推测子宫平滑肌异常收缩即宫缩强度增加可能是痛经的重要原因。OTR拮抗剂有可能作为一种新药来缓解子宫腺肌症引起的疼痛或达到治疗目的，期待为临床寻找治疗子宫腺肌症痛经的保守方法提供理论依据和实验数据。此外，本实验尚有不足，目前对疼痛程度的评估没有统一的标准[13]，实验中采取的痛经评分方法较主观；且由于样本例数较少，此结论有待于进行大样本、多中心研究，并长期观察加以证实。

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Expression of oxytocin receptor in smooth muscle of myometrium and its correlation with dysmenorrhea in adenomyosis

HU Xiaomei1, GUAN Zheng1, LI Jie1, LIU Aijun2, LIU Jinhong2, FAN Junzhen2, LI Yali1
1Department of Obstetrics and Gynecology;2Department of Pathology Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

GUAN Zheng. Email: GZ9332@aliyun.com

ObjectiveTo evaluate the expression level of oxytocin receptor (OTR) in smooth muscle of myometrium and its correlation with the degree of dysmenorrhea in adenomyosis.MethodsFifty AM cases and 20 uterine myoma cases admitted to department of gynecology in our hospital from September 2013 to August 2014 were enrolled in this study. Immunohistochemical S-P method was used to identify the expression of oxytocin receptor in smooth muscle of myometrium from 20 cases with pathologically confirmed normal myometrium and 50 female patients with pathologically confirmed adenomyosis. The expression level was detected by using digital image analysis with optical microscope and Image Pro-Plus 6.0.ResultsThe positive expression rates of OTR in smooth muscle of myometrium in AM group were higher than that in controls (62 370±34 758 vs 16 082±11 125, P＜0.01), and the expression level increased with the aggravation of dysmenorrhea. All the differences were statistically significant.ConclusionThe expression level of OTR in smooth muscle of myometrium is positively correlated with the degree of dysmenorrhea. This indicates that the increased intensity of uterine contraction is involved in the pathogenesis of dysmenorrhea.

adenomyosis; oxytocin receptor; myometrium; dysmenorrhea

R 711.74

A

2095-5227(2015)05-0451-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.05.012

时间：2015-02-03 10:32

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150203.1032.001.html

2014-11-02

胡小美，女，硕士。研究方向：子宫腺肌症痛经的相关因素及子宫内膜息肉的发病机制。Email: huxiaomeigbd@sina.com

关铮，女，博士，主任医师，教授。Email: GZ9332@ aliyun.com