食源性致病菌分子生物学检测中菌体分离富集与DNA提取技术研究进展

董 妍,胡文忠,何煜波,姜爱丽,萨仁高娃

(1.大连工业大学食品学院,辽宁大连 116600;2.大连民族学院生命科学学院,辽宁大连 116600;3.大连理工大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116024)

食源性致病菌分子生物学检测中菌体分离富集与DNA提取技术研究进展

董 妍1,胡文忠2,*,何煜波2,姜爱丽2,萨仁高娃3

(1.大连工业大学食品学院,辽宁大连 116600;2.大连民族学院生命科学学院,辽宁大连 116600;3.大连理工大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116024)

食源性致病菌DNA的数量及纯度严重影响后续分子生物学检测的准确性和灵敏性,因此随着分子生物学技术在食源性致病菌检测中的应用日渐广泛,细菌的分离、富集和DNA提取方法成为研究热点之一。本文综述了食源性致病菌的分离、富集和DNA提取的多种方法,以便研究开发更加快速、灵敏的分子生物学检测技术。

食源性致病菌,分离,富集,DNA提取,分子生物学

近年来,由食源性致病菌污染食品而引起的食品安全问题在全球范围内频频发生,如2008年荷兰暴发的沙门氏菌污染奶酪和肉制品事件、2011年美国暴发的香瓜李斯特菌中毒事件、2014年日本发生的肠出血性大肠杆菌O157∶H7大规模污染黄瓜事件等,造成消费者感染和死亡,严重危害了人类生命健康,给食源性疾病的预防及控制工作带来了巨大的挑战,因此,食源性致病菌的快速检测技术成为了国内外关注和研究的热点之一。食源性致病菌的传统检测技术已经越来越不能满足人们当今对食品质量与安全的要求,随着食源性致病菌检测技术的不断发展,分子生物学技术因具有特异性强、灵敏度高、快速简便等优点,已被广泛应用于各类食品的食源性致病菌的检测中。DNA提取是分子生物学检测技术的基础和关键技术环节之一,所提取的DNA的含量和质量不仅影响到检测的速度,也影响着检测的特异性和灵敏性。在食品中食源性致病菌的数量往往较少,而且存在着食品中的复杂基质影响分子生物学检测的准确性和有效性。因此,检测前对食源性致病菌进行分离、富集或选择高效的DNA提取方法是实现快速、特异、灵敏检测的重要基础。本文对食源性致病菌的分离、富集方法以及其DNA的几种提取方法进行了综述,以期为食源性致病菌的监督与检测、食源性疾病的预防与控制提供参考。

1 食源性致病菌的分离、富集技术

1.1 离心分离技术

离心分离技术主要是根据不同物质的沉降系数、质量、密度等因子的不同,利用离心力将菌悬液中的菌体与细菌培养液分开,使菌体脱离培养基质而富集在一起。离心分离技术普遍具有快速、简便、成本低等特点,特别是应用密度梯度离心技术可以分离不同种类的细菌,是一种应用较广泛的富集方法,但是离心分离技术还存在着粘附食品基质、大量细菌损失等缺点[1]。李引强[2]等人在应用试剂盒法提取牛奶样品中细菌DNA前,对样品进行了离心处理,基于16S rRNA-V3区克隆测序鉴定了细菌菌群,研究发现此方法可以提取到市售牛奶中的细菌DNA,并满足下游的实验要求。吴家林[3]等人用差速离心技术对猪肉模拟样品进行前处理,在应用多重PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7时,样品预增菌4 h后检测灵敏度能达到100CFU/mL。Fukushima[4]等人应用浮力密度梯度离心对食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌等12种致病菌进行了分离并富集,应用活细胞计数和实时荧光定量PCR技术进行检测后发现,富集后的菌体浓度是富集前的250倍,检测灵敏度为101～103CFU/g。

1.2 改良増菌培养基富集法

应用増菌培养基的前増菌过程可以增加致病菌的数量,从而有效提高致病菌的浓度,特别是选择性増菌能够抑制杂菌,提高检出率和准确性。对増菌培养基的改良主要体现在提高増菌效率、研究共増菌培养基等方面[5]。于海霞[6]等人对山梨醇麦康凯培养基和M-WS培养基对食品检验中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的分离能力进行了比较研究,M-WS培养基表现出了较强的抗杂菌干扰的能力,提高了食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的分离效率和检出率。吕晓萌[7]等人对PCR法检测大肠杆菌的增殖条件进行了优化研究,研究发现在LB培养基中添加0.3 g/100 mL的甘露醇和1.0%的乳糖,并辅以37 ℃、150 r/min的振荡培养,大肠杆菌的增殖效果最佳。翁思聪[8]等人设计了一种复合型増菌培养基可以使副溶血性弧菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌等4种水产品中常见的致病菌在同一培养基中生长,减少了培养基对多重PCR检测的影响,大幅度提高了检测效率。赵广英[9]等人以鱼蛋白胨为基础,改良了水产品中副溶血弧菌的増菌培养基,取得了较好的富集效果。

1.3 膜分离技术

高分子薄膜以压力差、浓度差等外界能量位差为推动力,可以对致病菌进行分离和富集。膜分离技术具有简便、快速、成本低等特点。但是分离后的细菌常浓缩于食品或滤膜上,还需要进一步洗脱和分离,并且洗脱效果严重影响着细菌的回收率,胡朝友[10]等人对仅辅以涡旋的膜洗脱方法进行了回收率的研究,发现较低浓度的菌体应用膜洗脱方法的回收率较低,浓度最低的回收率不足20%,针对此问题对应用滤膜富集饮用水中大肠杆菌的方法进行优化,结果表明在膜过滤前向水样中加入高浓度表皮葡萄球菌可以提高低浓度大肠杆菌的洗脱效率,并在膜过滤后采用涡旋和玻璃棒刮擦的方法处理滤膜,洗脱效率达74%～95%,对1000 mL不同浓度大肠杆菌进行富集和DNA提取后,全程的回收率为79.7%～104.0%,结合TaqMan探针实时荧光PCR技术的灵敏度为1 CFU/mL。Fitzmaurice[11]等人比较了膜分离技术和免疫磁性分离技术分别对牛肉样品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的富集能力,结合多重PCR反应检测后发现,当细菌增殖时间大于16 h时,牛肉样品中菌含量达到log109.6-7.5CFU/mL,膜分离技术可以达到与免疫磁性分离技术相当的富集能力。Jeníková[12]等人在对食品中沙门氏菌应用IMS-PCR技术进行检测前,将预富集样品通过应用膜分离技术制成的过滤袋,以去除食物残渣,降低了食物基质对检测的负面影响,提高了检测效率。

1.4 免疫磁性分离技术

免疫磁性分离技术利用相关抗体能够与细菌细胞表面抗原特异性结合的原理,以磁性物质为中介,在外磁场的作用下将致病菌从培养环境中分离出来。免疫磁性分离技术具有特异性强、灵敏度高、分离效果好等优点,但同时也存在着成本高、需要预处理、不适合大体积样品分离等缺点[1]。Xiong[13]等人对检测食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的免疫磁性分离技术进行了优化,优化后对细菌数量为101～106CFU/mL、磁珠用量为0.05 mg的肠出血性大肠杆菌O157∶H7捕获效率大于98%,对碎牛肉和牛奶样品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的捕获效率分别为94.4%和99.8%。Ma[14]等人使用基于免疫磁性分离技术的多重实时PCR技术同时检测新鲜猪肉中的沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌,灵敏度分别为2.0、6.8、9.6 CFU/g。Wang[15]等人将免疫磁性分离技术、叠氮溴化丙锭(PMA)、脱氧胆酸钠(SD)与qPCR技术结合检测牛奶样品中的肠出血性大肠杆菌O157∶H7,消除了死菌对检测的干扰,检出限为102CFU/mL。Zheng[16]等人应用实时PCR法结合免疫磁性分离技术对鸭翅原料中的鼠伤寒沙门氏菌进行了检测,检测时间为10 h,检出限为103CFU/mL。

近年来,纳米级磁性材料被广泛应用于食源性致病菌的分离中,纳米级磁性材料比普通的磁性微珠更加稳定,并且在扩散速度、与目标菌的结合能力等方面更强,具有快速、高效、抗干扰能力强等优点,但是同时也存在着对环境要求高、分离体积小等缺点[1]。钟子清[17]等人比较了抗体直接偶联、链霉亲和素-生物素介导偶联的纳米级免疫磁珠以及磁珠大小对单增李斯特菌捕获效率的影响,研究发现采用链霉亲和素-生物素介导偶联的180 nm免疫磁珠可以高效的富集单增李斯特菌。Yang[18]等人应用纳米级免疫磁性粒子结合实时定量PCR技术检测牛奶样品中的单增李斯特菌,捕获效率是普通免疫磁性分离的1.4～26倍,检测的灵敏度为452 CFU/mL。Yang[19]等人应用纳米磁珠分离食品中的鼠伤寒沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌O157∶H7和李斯特菌菌细胞,并结合PMA-PCR检测技术,食品样本中的检出限为103CFU/mL。

2 食源性致病菌DNA的提取技术

2.1 有机溶剂抽提法

有机溶剂抽提法在致病菌DNA提取中应用较为广泛,也是许多改良方法的基础,主要是利用蛋白酶K等破碎菌细胞,用酚-氯仿等有机溶剂除去蛋白质,最后用乙醇等沉淀DNA。此方法虽然提取效率较高、DNA纯度较好,但存在着操作繁琐、干扰后续反应、有一定毒性等缺点。Gordillo[20]等人对肉制品中的肠出血性大肠杆菌O157∶H7进行煮沸冷却和溶菌酶处理后,应用酚/氯仿混合物、乙醇等有机物提取DNA,结合qPCR技术检测,富集后检测限为1 CFU/g,检测时间8 h。Fakruddin[21]等人应用酚/氯仿-乙醇方法分离斑节对虾中出血性大肠杆菌O157∶H7、沙门氏菌、霍乱弧菌和副溶血性弧菌的DNA,并结合多重PCR反应进行检测,获得了良好的特异性和灵敏性。Kawasaki[22]等人对肉类、鱼等食品中沙门氏菌、单增李斯特菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7进行了多重PCR检测,应用异硫氰酸胍和异丙醇等有机物提取细菌DNA,经20 h増菌的人工接种样品的检出限为5 CFU/25 g,同时对食品在冷冻储藏期内致病菌的检出率进行了监测。

2.2 水煮法

水煮法利用高温破碎菌细胞,并使蛋白质变性而收集DNA。此方法简单、快速,且成本较低。但同时应用水煮法提取食品样品中致病菌的DNA时,DNA的纯度在很大程度上会受到食品样品种类的影响,陈伟[23]等人应用水煮法提取肉制品中志贺氏菌的DNA,以研究其对PCR检测灵敏度的影响,此方法所提取DNA的OD260/OD280的值为1.0252,检出限为5×103CFU/mL,分析认为应用水煮法处理肉制品使得产物中含有大量的蛋白质等杂质,降低了产物的纯度,从而影响检测的灵敏度。Zarei[24]等人应用水煮法提取多种肉类产品中的肠出血性大肠杆菌O157∶H7和单增李斯特菌的DNA,结合多重PCR反应分析了伊朗西南部肉类商品中两种致病菌的检出率。Kim[25]等人在应用荧光定量PCR反应检测鲜切甘蓝中肠出血性大肠杆菌时,采用水煮法提取细菌DNA,检测时间少于9 h,检出限为1.53 log CFU/mL。Son[26]等人应用水煮法对五种产志贺毒素大肠杆菌提取DNA,进行了多重PCR反应检测并应用于人工接种的菠菜、苜蓿芽和香菜中,此方法具有快速、特异的特点。

2.3 Triton X-100裂解法

Triton X-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚,是烷基酚与环氧乙烷的缩合物,属于非离子型表面活性剂,可使膜蛋白充分溶解从而分离DNA,此方法简单、快速。但当使用此方法提取某些具有荚膜等结构的细菌时所得DNA的纯度不高,苏丽婷[27]等人对应用Triton X-100裂解法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA进行了研究,发现所提取DNA的OD260/OD280值一般在0.69左右,PCR检测的灵敏度不高。Vidal[28]等人对引起食源性疾病暴发的三种致泻性大肠杆菌(肠出血性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌)进行多重PCR检测时,采用了0.5%的Triton X-100煮沸提取致病菌的DNA。徐伟[29]等人分别用Triton X-100法、溶菌酶+蛋白酶K法、Tween-20法提取灭菌脱脂乳中的单增李斯特菌和志贺氏菌DNA,进行比较后发现,Triton X-100法和Tween-20法符合检测要求,应用多重PCR技术检测后,检出限分别为2 CFU/25 mL、1.6 CFU/25 mL。魏华[30]等人比较了水煮法、Triton X-100直接裂解法、Triton X-100煮沸裂解法对大肠杆菌DNA的提取效果,并结合ERIC-PCR技术进行检测,结果表明三种提取方法效果一致,均可获得应用于ERIC-PCR技术的有效扩增模板。

2.4 Chelex-100法

Chelex-100是一种聚苯乙烯基体离子交换树脂,该树脂悬液可以在碱性、100 ℃的条件下破碎菌细胞并使蛋白质变性,从而释放DNA。Chelex-100法可螯合金属离子,在煮沸过程中能够保护DNA并减少抑制PCR反应的物质,操作简单、快速,但其所提取的DNA纯度不如用试剂盒法所提取DNA的纯度[31],并且所提取的DNA保存时间超过6个月会影响PCR实验的重复性[32]。钱雪琴[33]等人采用Chelex-100法提取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的DNA,利用通用引物扩增16SrDNA片段检测两种菌的灵敏度均为1.2×101CFU/mL。郑鸣[34]等人将Chelex-100法与环介导间接聚合酶链式反应结合检测肉制品中的单增李斯特菌,人工污染的鲜肉和牛奶检的灵敏度均为100 CFU/g(mL),对市场上200份不同的肉制品进行了检测,阳性率与传统培养法一致。Malorny[35]等人应用Chelex-100法提取食品中的沙门氏菌并应用荧光定量PCR技术进行检测,对多株沙门氏菌菌株和非沙门氏菌菌株检测的检出率为100%时,检出限为104CFU/mL,对110种食品样本检测的准确性为100%。

2.5 FTA滤膜法

FTA(Flinders Technology Associates,FTA)滤膜或FTA卡是一种特制的滤膜,它可以裂解细胞并将DNA吸附在其上,经干燥后长期保存DNA。此方法能够去除杂质及抑制PCR反应的物质,无需洗脱DNA避免了DNA的损失,简单快速。Lampel[36]等人将FTA滤膜法与PCR反应结合,分别对农产品、牛肉等几种食品中的志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和李斯特菌进行了检测,志贺氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的灵敏度为30～50 CFU/mL,李斯特菌的灵敏度为200 CFU/mL。任立松[37]等人应用水煮法、FTA滤膜法、试剂盒法分别对阪崎肠杆菌提取DNA,并应用于环介导等温扩增技术中,发现应用FTA滤膜法和试剂盒法提取DNA效果优于水煮法,FTA滤膜法更简单、快速,灵敏度为103CFU/mL。但是应用此方法时需对滤膜大小等参数进行优化,并且卡片本身含有少量抑制PCR反应的物质,陈霖祥[38]等人针对此问题对FTA样品卡的大小和卡片上DNA提取量进行了优化,发现6.0×104-7CFU/mL的金黄色葡萄球菌菌悬液制备的0.5 mm卡片在荧光PCR-16S rDNA测序反应中Cp值较好。

2.6 磁性材料吸附法

选择与致病菌特异性基因片段互补的寡核苷酸片段修饰磁性材料,可以选择性的分离目标DNA,此方法具有灵敏、快速、杂质干扰小的特点,但是对生物亲和分子和磁场的要求高[1]。Amagliani[39]等人应用顺磁性纳米粒子分离牛奶样品中的李斯特菌,结合PCR检测技术,灵敏度为10 CFU/mL,与应用柱分离技术商品提取的DNA相比,灵敏度提高了10倍。随后Amagliani[40]等人还使用了氨基改性的顺磁性纳米粒子分离海产品中的沙门氏菌和李斯特菌的DNA,结合三重荧光定量PCR检测技术,能够对増菌前细菌浓度为1 CFU/g的样品进行检测,与标准检测方法结果一致。Omiccioli[41]等人采用磁性材料从牛奶样品中提取沙门氏菌、单增李斯特菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7的DNA,并应用于多重PCR反应中,能够检测出菌浓度为10 cells/mL的牛奶样品。

3 展望

目前,食品安全问题是全球关注的焦点,其中由食源性致病菌引起的食源性疾病因具有高发病率、高致死率、传播能力强等特点,成为食品安全问题中的首要问题,据统计,我国每年发生细菌性食物中毒占食物中毒事件的30%～90%,其中人数占60%～90%[42]。食品基质会对其中致病菌DNA的分离和提取造成很大的影响,继而影响检测的灵敏性。食品基质主要的影响作用体现在两方面:一是食品基质经破碎处理后,残留物质与致病菌相比体积依然较大,此时致病菌会粘附在食品基质上,不利于分离,造成所得致病菌数量小于实际食品中致病菌的数量,易造成漏检的结果[1];二是食品基质中存在着干扰PCR检测的物质,比如在肉制品中存在着脂肪、金属离子等抑制PCR反应的物质[23],在乳品中抑制PCR反应的物质主要是脂肪、多糖、蛋白质等[43],并且不同食品基质中同种抑制因子也会对PCR检测产生不同影响,杨洋[44]等人研究发现从全脂乳和脱脂乳中提取金黄色葡萄球菌的DNA,与从干酪中提取金黄色葡萄球菌的DNA相比,前者用于PCR检测的效果更好,主要原因是后者的脂肪含量远高于前者,影响了致病菌DNA的提取和PCR检测。因此,对不同种类食品中的食源性致病菌建立快速、灵敏、特异、准确的分子生物学检测技术,对有效控制食源性致病菌的传播、预防食源性疾病的暴发至关重要。研究在短时间内获得大量的、高纯度的细菌基因组DNA的富集、提取方法以满足检测效率、检出限的要求,具有着重要的实际意义。

在今后的研究中,对食源性致病菌的分离、富集以及DNA提取的研究主要发展趋势主要有以下四点。首先,要简化DNA提取步骤,避免反复提取而造成DNA的损失,同时也能够缩短提取时间,从而提高检测效率。第二,要加强对提高DNA纯度的研究,在分离、富集过程中尽量选择特异性富集,提取过程中尽量去除蛋白质、RNA等物质,以满足分子生物学技术高特异性、高灵敏性的要求。第三,避免采用对PCR反应抑制作用强烈、对环境有污染、破坏DNA的富集和提取方法。第四,要研究具有较强分离能力的分离方法,并针对不同样品中抑制PCR反应物质的特点,采用适合的提取方式。

[1]黄小林,许恒毅,熊勇华,等.磁性纳米材料在食源性致病菌分离中应用的研究进展[J].食品科学,2014,35(11):280-285.

[2]李引强,朱宝利,吴俊,等.16S rRNA的分子生物学方法分析牛奶中的细菌菌群[J].食品科学,2013,34(20):255-260.

[3]吴家林,肖勇,凌霞,等.肠出血性大肠杆菌O157∶H7多重PCR快速检测研究[J].现代预防医学,2009,36(1):117-119

[4]Fukushima H,Katsube K,Hata Y,et al. Rapid separation and concentration of food-borne pathogens in food samples prior to quantification by viable-cell counting and real-time PCR[J]. Applied and Environmental Microbiology,2007,73(1):92-100.

[5]Kim H,Bhunia A K. SEL,a selective enrichment broth for simultaneous growth of Salmonella enterica,Escherichia coli O157∶H7,and Listeria monocytogenes[J]. Applied and environmental microbiology,2008,74(15):4853-4866.

[6]于海霞.食物检验中肠出血性大肠杆菌的分离培养基研究分析[J].轻工标准与质量,2013(3):42-43.

[7]吕晓萌,胡文忠,冯叙桥,等.PCR法检测大肠杆菌的增殖条件优化研究[J].食品工业科技,2014,35(17):134-136.

[8]翁思聪,朱军莉,励建荣.水产品中4种常见致病菌多重PCR检测方法的建立及评价[J].水产学报,2011,35(2):305-314.

[9]赵广英,申科敏,励建荣.副溶血性弧菌增菌培养基及培养条件的改进[J].水产科学,2010,29(3):137-141.

[10]胡朝友,傅春玲,张宏斌.饮用水中大肠埃希菌富集和DNA提取方法优化[J].中国食品卫生杂志,2014,26(001):36-39.

[11]Fitzmaurice J,Duffy G,Kilbride B,et al. Comparison of a membrane surface adhesion recovery method with an IMS method for use in a polymerase chain reaction method to detect Escherichia coli O157∶H7 in minced beef[J]. Journal of microbiological methods,2004,59(2):243-252.

[12]Jeníková G,Pazlarová J,Demnerová K. Detection of Salmonella in food samples by the combination of immunomagnetic separation and PCR assay[J]. International Microbiology,2010,3(4):225-229.

[13]Xiong Q,Cui X,Saini J K,et al. Development of an immunomagnetic separation method for efficient enrichment of Escherichia coli O157∶H7[J]. Food control,2014(37):41-45.

[14]Ma K,Deng Y,Bai Y,et al. Rapid and simultaneous detection of Salmonella,Shigella,and Staphylococcus aureus in fresh pork using a multiplex real-time PCR assay based on immunomagnetic separation[J]. Food Control,2014(42):87-93.

[15]Wang L,Li P,Zhang Z,et al. Rapid and accurate detection of viable Escherichia coli O157∶H7 in milk using a combined IMS,sodium deoxycholate,PMA and real-time quantitative PCR process[J]. Food Control,2014,36(1):119-125.

[16]Zheng Q,Mikš-Krajnik M,Yang Y,et al. Real-time PCR method combined with immunomagnetic separation for detecting healthy and heat-injured Salmonella Typhimurium on raw duck wings[J]. International journal of food microbiology,2014(186):6-13.

[17]钟子清,熊勇华,赖卫华,等.纳米免疫磁珠富集单核增生李斯特菌[J].食品科学,2013,34(23):212-215.

[18]YANG H,QU L W,WIMBROW A N,et al. Rapid detection of Listeria monocytogenes by nanoparticle-based immunomagnetic separation and real-time PCR[J].International Journal of Food Microbiology,2007,118(2):132-138.

[19]Yang Y,Xu F,Xu H,et al. Magnetic nano-beads based separation combined with propidium monoazide treatment and multiplex PCR assay for simultaneous detection of viable Salmonella Typhimurium,Escherichia coli O157∶H7 and Listeria monocytogenes in food products[J]. Food microbiology,2013,34(2):418-424.

[20]Gordillo R,Rodríguez A,Werning M L,et al. Quantification of viable Escherichia coli O157∶H7 in meat products by duplex real-time PCR assays[J]. Meat science,2014,96(2):964-970.

[21]Fakruddin M D,Sultana M,Ahmed M M,et al. Multiplex PCR(polymerase chain reaction)assay for detection of E. coli O157∶H7,Salmonella sp.,Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus in spiked shrimps(Penaeus monodon)[J]. Pakistan journal of biological sciences:PJBS,2013,16(6):267-274.

[22]Kawasaki S,Fratamico P M,Horikoshi N,et al. Evaluation of a multiplex PCR system for simultaneous detection of Salmonella spp.,Listeria monocytogenes,and Escherichia coli O157∶H7 in foods and in food subjected to freezing[J]. Foodborne pathogens and disease,2009,6(1):81-89.

[23]陈伟,李正国,杨平,等.肉制品中志贺氏菌DNA的快速提取方法[J].食品与发酵工业,2009(5):12-15.

[24]Zarei M,Basiri N,Jamnejad A,et al. Prevalence of Escherichia coli O157∶H7,Listeria monocytogenes and Salmonella spp. in Beef,Buffalo and Lamb Using Multiplex PCR[J]. Jundishapur Journal of Microbiology,2013,6(8):463-468.

[25]Kim Y J,Kim J G,Oh S W. Rapid detection of Escherichia coli O157∶H7 in fresh-cut cabbage by real-time polymerase chain reaction[J]. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry,2011,54(2):264-268.

[26]Son I,Binet R,Maounounen-Laasri A,et al. Detection of five Shiga toxin-producing Escherichia coli genes with multiplex PCR[J]. Food microbiology,2014(40):31-40.

[27]苏丽婷,梁景龙,郭小建,等.金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法的比较[J].仲恺农业工程学院学报,2011,24(1):15-19.

[28]Vidal R,Vidal M,Lagos R,et al. Multiplex PCR for Diagnosis of Enteric Infections Associated with Diarrheagenic Escherichia coli[J].Journal of Clinical Microbiology,2004,42(4):1787-1789.

[29]徐伟,刘军,李素芳.单增李斯特菌与志贺氏菌多重PCR检测技术的建立[J].中国食品学报,2009,9(1):201-207.

[30]魏华,孙立国,朱晶,等.不同的DNA提取法对两种常见医院感染菌ERIC-PCR鉴定的影响研究[J].中华医院感染学杂志,2007,17(9):1044-1047.

[31]夏涵,府伟灵,陈鸣,等.快速提取细菌DNA方法的研究[J].现代预防医学,2005,32(5):571-573.

[32]黄晓晶,刘天佳,蔡志宇.用Chelex法制备AP-PCR细菌DNA模板[J].福建医科大学学报,2002,36(2):221-223.

[33]钱雪琴,张军,沈芳.Chelex-100法和碱性裂解法提取细菌DNA的比较[J].中国卫生检验杂志,2008,18(8):1565-1566.

[34]郑鸣,边传周,刘仲敏.Chelex法结合环介导间接聚合酶链式反应检测肉制品单增李斯特菌[J].食品科学,2012,33(10):190-194.

[35]Malorny B,Paccassoni E,Fach P,et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food[J]. Applied and Environmental Microbiology,2004,70(12):7046-7052.

[36]Lampel K A,Orlandi P A,Kornegay L. Improved template preparation for PCR-based assays for detection of food-borne bacterial pathogens[J]. Applied and environmental microbiology,2000,66(10):4539-4542.

[37]任立松,陈梦馨,陈卓,等.环介质等温扩增技术快速检测阪崎肠杆菌的方法[J].食品科学,2013,34(12):296-299.

[38]陈霖祥,蔡颖,周广彪,等.荧光PCR-16S rDNA测序法鉴定金黄色葡萄球菌的FTA卡制备DNA模板条件的优化[J]. 汕头大学医学院学报,2013(3):005.

[39]Amagliani G,Brandi G,Omiccioli E,et al. Direct detection of Listeria monocytogenes from milk by magnetic based DNA isolation and PCR[J]. Food microbiology,2004,21(5):597-603.

[40]Amagliani G,Omiccioli E,Brandi G,et al. A multiplex magnetic capture hybridisation and multiplex real-time PCR protocol for pathogen detection in seafood[J]. Food microbiology,2010,27(5):580-585.

[41]Omiccioli E,Amagliani G,Brandi G,et al. Simultaneous direct detection of Salmonella spp.,Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk samples by magnetic extraction and multiplex PCR[J]. Journal of Rapid Methods & Automation in Microbiology,2009,17(2):195-213.

[42]程晓艳,刘庆慧,黄健. 5种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立[J].渔业科学进展,2012,33(2):97-103.

[43]舒畅,姜琛璐,钟慈平,等.三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立[J].食品工业科技,2014,35(12):49-54.

[44]杨洋,张伟,袁耀武,等.用于PCR检测的乳品中金黄色葡萄球菌DNA提取方法比较研究[J].食品与发酵工业,2006,31(9):91-95.

Research progress in separation,enrichment and DNA extraction of foodborne pathogens based on molecular biological technology

DONG Yan1,HU Wen-zhong2,*,HE Yu-bo2,JIANG Ai-li2,SA-Ren-gao-wa3

(1.College of Food Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China;2.College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China;3.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

The quantity and purity of foodborne pathogens’ DNA affect the accuracy and sensitivity of molecular biological technology seriously. The separation,enrichment and DNA extraction of bacteria in detecting foodborne pathogens become research hotspot with the application of molecular biological technology. In this paper,the separation,enrichment and DNA extraction of foodborne pathogens are summarized to development more rapid and sensitive molecular biological technology.

foodborne pathogens;separation;enrichment;DNA extraction;molecular biology

2015-02-09

董妍(1989-),女,在读硕士,研究方向:食品安全,E-mail:dong_yan@126.com。

*通讯作者:胡文忠(1959-),男,博士,教授,研究方向:食品科学,E-mail:hwz@dlnu.edu.cn。

国家科技支撑计划项目(2012BAD38B05);国家自然科学基金项目(31172009);大连科技计划项目(2012E13SF106)。

TS255.3

A

1002-0306(2015)23-0371-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.069