6种云杉属植物花粉活性测定

刘禹廷，蓝登明*，余伟莅，刘平生，赵 丽

(1.内蒙古农业大学生态环境学院，内蒙古呼和浩特 010019；2.内蒙古林业科学研究院，内蒙古呼和浩特 010019)



6种云杉属植物花粉活性测定

刘禹廷1，蓝登明1*，余伟莅2，刘平生2，赵 丽2

(1.内蒙古农业大学生态环境学院，内蒙古呼和浩特 010019；2.内蒙古林业科学研究院，内蒙古呼和浩特 010019)

以引种栽培30～40年云杉树种为研究对象，通过对花粉进行生活力测定，从而分析并探讨引种云杉繁殖能力对环境的适应性特征，为今后开展杂交育种工作提供理论依据。文章采用4种花粉活性测定方法对6种云杉花粉进行活性测定试验，得出以下结果：4种方法中，I2-KI染色法和醋酸洋红染色法染色效果不佳，TTC染色法和离体培养法试验效果较好，用TTC染色法和离体培养法对花粉进行活性测定，花粉活性均表现为白扦活性最高，粗枝云杉活性最低，且不同云杉花粉最适培养基中蔗糖浓度不同，多数以15 g/ml的蔗糖浓度萌发效果最好，而青海云杉以10 g/ml的蔗糖浓度萌发效果最佳。6种云杉花粉最适培养基中硼酸浓度均为0.05 g/ml。

云杉花粉；活性；测定方法

云杉(Picea)为松科常绿乔木，全世界有42种14变种，主要分布于北温带[1]。我国有18种7变种，另引种栽培2种[2]，是云杉属树种最多的国家[3]。该属树种生态适应性强，耐阴、耐寒、耐干旱，其木材品质好、用途广，是北方地区重要的城市绿化和用材树种[4]。

20世纪70、80年代，为了丰富内蒙古呼和浩特地区云杉树木种类，增大该地区的生态和经济效益[5]，内蒙古林业科学研究院先后将国内外多种云杉引种到树木园[6]，至今已有30～40年的引种时间。为了探究引种云杉对环境的适应性特征，以其繁殖能力作为评定引种树木适应性强弱的主要指标。针对这一指标了解到，在自然授粉情况下，引种云杉结实率很低[7]，因此对云杉花粉萌发、生长、发育等生活力指标进行测定[8]，为人工辅助授粉及杂交授粉提供参考依据，从而提高引种云杉的结实率和育种效率。花粉生活力测定方法一般包括染色法、离体培养法和花粉授粉结实检测法等[9]。该试验采用I2-KI染色法[9]、醋酸洋红染色法[10]、TTC染色法[11]和离体培养法[12-13]这4种方法，对6种云杉属植物花粉进行活性测定，旨在为云杉杂交育种和进一步花粉研究提供依据[14]。

1 材料与方法

1.1 供试材料 选取内蒙古林业科学研究院树木园内生长状况良好的引种云杉为试验树种，其中包括青海云杉(PiceacrassifoliaKom.)、欧洲云杉[P.abies(L.) Karst.]、白扦(P.meyeriRehd.ex Wils)、鳞皮云杉(P.retroflexaMast. )、紫果云杉(P.purpureaMast.)和粗枝云杉(P.asperataMast.)，引进树种及种源如表1所示。在2014年6月10号前后分别摘取雄花数枚，经过充分自然干燥后进行试验。

表1 树木园引进树种及种源

1.2 研究方法

1.2.1 花粉萌发率测定方法。

1.2.1.1 离体培养法测定云杉属植物花粉萌发率。按表2所示计量配置培养基[15]，将配好的培养基和所需玻璃培养皿放在高温灭菌锅中灭菌，2.5 h后将培养皿取出，与试验器材一同放置在紫外灯下灭菌15 min。再将未凝固的培养基均匀涂抹在载玻片上，用毛笔在培养基上撒开花粉，放进有湿润滤纸的培养皿中，在25 ℃的恒温箱中培养15～48 h，期间用显微镜观察花粉萌发情况。以花粉管长度≥花粉粒短径的1/2记为萌发，每种云杉花粉进行3次重复，拍照统计其萌发率[16]。

表2 L9(34)因素水平 g/ml

1.2.1.2 萌发率计算公式。萌发率=萌发的花粉数/观察花粉总数×100%

1.2.2 染色法测定花粉活性。

1.2.2.1 TTC染色法测定云杉属植物花粉活性。配置pH为7.0的磷酸缓冲液，取10 ml，将0.01 g的TTC溶于磷酸缓冲液中，充分摇匀。用毛笔将花粉在载玻片上轻轻撒开，滴加1～2滴配置好的TTC溶液，盖上盖玻片，放入湿润滤纸培养皿中，在35 ℃的恒温箱中放置30～60 min，用显微镜观察染色情况。花粉被染成红色，代表其具有活性，每种云杉花粉进行3个重复，拍照统计。

1.2.2.2 I2-KI染色法测定云杉属植物花粉活性。将配好后的I2-KI溶液置于棕色瓶中。用毛笔将花粉在载玻片上轻轻撒开，滴加1～2滴I2-KI溶液，盖上盖玻片,然后在显微镜下检查5个视野。花粉被染成蓝色，代表其具有活性；花粉被染成黄褐色，代表其不具有活性。每种云杉花粉进行3个重复，拍照统计。

1.2.2.3 醋酸洋红染色法测定云杉属植物花粉活性。在100 ml浓度为45%的冰醋酸溶液中加入1 g洋红粉末，并置于火源加热，同时搅拌直到沸腾取出，待冷却后加入1～2滴浓度2%的铁明矾，然后过滤2～3次，装入棕色瓶。用毛笔将花粉在载玻片上轻轻撒开，滴加1～2滴配置好的醋酸洋红溶液，盖上盖玻片，1～2 min后，置于显微镜下检查5个视野。花粉被染成红色，代表其具有活性。每种云杉花粉进行3个重复，拍照统计。

1.2.2.4 花粉活性计算公式。花粉活性=视野内被染色的花粉数/视野内花粉总数×100%

2 结果与分析

2.1 不同染色方法对6种云杉花粉活性的影响

2.1.1 I2-KI染色法对云杉花粉活性的影响。用I2-KI染色法对6种云杉花粉的活性进行测定，大多花粉呈现黄褐色(图1，图中显示为黑色花粉管)，有些花粉无色(图中显示为浅灰色花粉管)，但没有蓝色反应，染色效果不理想，不能对云杉花粉进行有效的统计，说明I2-KI染色法不适用于云杉花粉活性试验。

2.1.2 醋酸洋红染色法对云杉花粉活性的影响。在醋酸洋红染色法测定6种云杉花粉活性的试验中，花粉几乎没有显色反应，只有2～3粒花粉呈现浅粉色(图2，图中显示为黑色花粉管)，其余花粉均没有颜色反应(图中显示为白色花粉管)，不能有效证明花粉是否有活性，因此醋酸洋红染色法在对云杉花粉染色试验中不适用。

2.1.3 TTC染色法对云杉花粉活性的影响。在TTC染色法测定6种云杉花粉活性的试验中，染色效果明显，有活性的花粉，其花粉呈现红色或粉色(图3，图中显示为黑色花粉管)，无活性的花粉其花粉无色(图中显示为浅灰色花粉管)，颜色差异明显，由统计结果可知TTC染色法可对云杉花粉进行染色试验。

2.2 不同培养基对6种云杉花粉萌发率的影响 用离体培养法对云杉花粉进行体外培养，6种云杉花粉的花粉管萌发状态差异明显，花粉管长度≥花粉粒短径的1/2为萌发,代表花粉有活性，相反则代表没有活性(图4)。

通过运用直观分析法对表3～6进行统计分析可知，白扦、紫果云杉、欧洲云杉和鳞皮云杉9个培养基中，均为7号培养基试验效果最佳，花粉萌发率最高。按因素水平来看，萌发率越大越好，故应选取使指标大的水平，即A因素列：k3>k1>k2；B因素列：k1>k3>k2；C因素列：k2>k3>k1。对于极差R值的比较，可以看出试验因素存在的显著性顺序为B>A>C，因此白扦、紫果云杉、欧洲云杉和鳞皮云杉花粉萌发的优方案为B1A3C2，即蔗糖浓度15 g/ml，硼酸浓度0.05 g/ml，琼脂浓度1.0 g/ml为最佳配比方案。

表3 白扦花粉萌发率正交试验结果

表4 紫果云杉花粉萌发率正交试验结果

由表7可知，在粗枝云杉9个培养基中，7号培养基试验效果最佳，花粉萌发率最高。按因素水平来看，A因素列：k3>k2>k1；B因素列：k1>k2>k3；C因素列：k3>k1>k2。对于极差R值的比较，试验因素存在的显著性顺序为B>A>C，因此粗枝云杉花粉萌发的优方案为B1A3C3，即蔗糖浓度15 g/ml，硼酸浓度0.05 g/ml，琼脂浓度1.5 g/ml为最佳配比方案。

表5 欧洲云杉花粉萌发率正交试验结果

表6 鳞皮云杉花粉萌发率正交试验结果

表7 粗枝云杉花粉萌发率正交试验结果

由表8可知，青海云杉以4号培养基花粉萌发率最高。按因素水平来看，A因素列：k2>k1>k3；B因素列：k1>k2>k3；C因素列：k1>k2>k3。对于极差R值的比较，试验因素存在的显著性顺序为B>A>C，因此青海云杉花粉萌发的优方案为B1A2C1，即蔗糖浓度10 g/ml，硼酸浓度0.05 g/ml，琼脂浓度0.5 g/ml为最佳配比方案。

表8 青海云杉花粉萌发率正交试验结果

2.3 同种测定方法下6种云杉属植物花粉活性比较 对TTC染色试验中6种花粉活性统计可得图5。由图5可知，白扦花粉活性最高，活性最低的为粗枝云杉。活性最低的花粉与活性最高的花粉其花粉活性相差27.5个百分点。不同云杉花粉活性依次为：白扦花粉活性>青海云杉花粉活性>紫果云杉花粉活性>欧洲云杉花粉活性>鳞皮云杉花粉活性>粗枝云杉花粉活性。

图6为离体培养法测定的6种云杉花粉萌发率统计图。选取每种花粉9个培养基中萌发率最大值，作为该云杉树种最佳萌发状态下的萌发率。将6种云杉萌发率进行比较分析可得，白扦花粉萌发率最高，粗枝云杉花粉萌发率最低，二者花粉萌发率相差35.57个百分点，差异极显著。不同云杉花粉萌发率依次为：白扦花粉萌发率>紫果云杉花粉萌发率>青海云杉花粉萌发率>欧洲云杉花粉萌发率>鳞皮云杉花粉萌发率>粗枝云杉花粉萌发率。

由于青海云杉和紫果云杉花粉在这2种活性测定方法中所表现出的活性大小顺序不同，因此利用SPSS对这2种云杉花粉活性进行单因素方差分析，结果显示二者无显著性差异，说明青海云杉和紫果云杉花粉活性在同一水平。

对离体培养法和TTC染色法进行相关性分析，结果见表9。由表9可知，这2种花粉活性测定方法呈正相关性，且相关性极强。相关系数为0.958，决定系数为91.78%，表明离体培养法方差的91.78%可以用TTC染色法来解释。说明离体培养法测定云杉花粉活性较高时，TTC染色法测定云杉花粉活性也较高，因此在云杉花粉活性测定的试验中，可以选择试验步骤较简单的TTC染色法代替离体培养法对其进行活性测定。

表9 离体培养法与TTC染色法相关性分析

注：*表示在0.01水平上显著相关。

3 结论

(1)在4种花粉活性测定方法中，I2-KI染色法和醋酸洋红染色法对6种云杉花粉均没有明显的色差反应。TTC染色法与离体培养法活性测定情况较好。

(2)6种云杉最适培养基中硼酸浓度为0.05 g/ml萌发效果最好。白扦、紫果云杉、欧洲云杉、鳞皮云杉和粗枝云杉培养基中蔗糖最适浓度为15 g/ml，而青海云杉为10 g/ml。青海云杉培养基中琼脂最适浓度为0.5 g/ml，白扦、紫果云杉、欧洲云杉、鳞皮云杉为1.0 g/ml，粗枝云杉为1.5 g/ml。

(3)通过对6种云杉花粉进行活性检测，反映出花粉活性大小依次为：白扦花粉活性、青海云杉花粉活性、紫果云杉花粉活性、欧洲云杉花粉活性、鳞皮云杉花粉活性、粗枝云杉花粉活性。

(4)TTC染色法可以代替离体培养法对云杉花粉进行活性测定。

4 讨论

(1)从原理角度来看，TTC染色法适合于花粉呼吸作用较强的植物，通过花粉呼吸作用所产生的NADH2或NADPH2与TTC反应，变成红色产物TTF。运用这种色差反应可判断花粉活性。铁军等[11]运用TTC染色法对芦荟属植物进行花粉活性测定试验，试验效果较好。I2-KI染色法是根据其遇淀粉变蓝的反应原理来论证花粉的活性，此方法不适用于云杉花粉，说明云杉花粉中含淀粉较少，不能与I2-KI溶液进行反应。醋酸洋红法是对花粉体内积累的物质进行吸附作用从而染色，而云杉花粉极难染色，说明吸附作用太弱导致染色效果不佳。董晓莉等[9]在研究连翘花粉活力时发现醋酸洋红法适合连翘花粉活力测定试验。该试验还发现在云杉花粉活性测定试验中TTC染色法与离体培养法相关性极强，因此TTC染色法可以代替离体培养法对云杉花粉进行活性测定。

(2)利用SPSS对离体培养法中花粉萌发率进行方差分析，结果显示硼酸和蔗糖的浓度对云杉花粉萌发具有显著的影响。这一结论与马健伟等[17]的研究结果大致相似。不同云杉花粉对培养基中最适蔗糖浓度不同，蔗糖作为碳源是花粉萌发及花粉管臂合成所必不可少的主要营养物质来源，多数云杉树种以15 g/ml的蔗糖浓度试验效果最好，这与葛莉莉等[18]的研究结果基本相同。但青海云杉以10 g/ml的蔗糖浓度试验效果最佳，说明青海云杉花粉对于糖的吸收与其他5种云杉树种相比可能较低。

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The Assay about the Activity of Six Kinds ofPiceaPollen

LIU Yu-ting1, LAN Deng-ming1*,YU Wei-li2et al

(1. College of Ecology and Environmental Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot, Inner Mongolia 010019; 2. Inner Mongolia Academy of Forestry, Hohhot, Inner Mongolia 010019)

With introduced 30-40 yearsPiceaas research object, through determination of pollen activity, the adaptability of introducedPiceato environment was analyzed and discussed, which will provide theoretical basis for carrying out hybrid breeding work. Four pollen activity determination methods were adopted to conduct experiments on six kinds ofPiceapollen. The results showed tha among four kinds of methods, I2-KI staining and acetocarmine staining are poor test results, TTC staining andinvitroculture test are better. By TTC staining and in vitro culture method for measuring the activity of pollen, pollen activity showedP.meyeriis the highest, the lowest activity isP.asperata. And differentPiceapollen optimum concentration of sucrose are different, most are 15 g/ml of the sucrose concentration test the best, however,P.crassifoliais 10 g/ml sucrose concentration test the best results. Six kinds ofPiceapollen optimum concentration of boric acid in the culture medium was 0.05 g/ml.

Piceapollen; Activity; Assay method

内蒙古林业厅科技支撑项目(内林科研[2013]2号)。

刘禹廷(1990-)，女，内蒙古乌海人，硕士研究生，研究方向：植物多样性保护与利用。*通讯作者，教授，从事野生植物资源保护与利用研究。

2015-04-20

S 791.18

A

0517-6611(2015)17-241-05