PCV2Rep蛋白N－糖基化位点突变对病毒复制的影响

徐胜男，时建立，彭 喆，徐绍建，吴晓燕，丛晓燕，杜以军，吴家强，李 俊＊，王金宝＊

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109；2.山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南250100；3.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南250100）

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）是1974年由德国学者Tischer等首次从猪肾传代细胞（PK15）中分离得到，1982年被命名为猪圆环病毒［1］。猪圆环病毒分为两个血清型，即PCV1和PCV2。其中，只有PCV2具有致病性，能引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Post weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS），皮炎和肾病综合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS），增生性坏死性间质性肺炎（Proliferative and necrotizing pneumonia，PNP）等疾病［2］，给养猪业造成严重的经济损失。目前该病毒已成为国内外研究的热点，但其致病机制目前尚未完全清楚。

猪圆环病毒2型主要由与病毒复制相关的Rep蛋白，与免疫原性相关的Cap蛋白及ORF3编码的与细胞凋亡相关的非结构蛋白3种蛋白组成［3］，其中Rep蛋白含有3个N－糖基化位点，即23～25aa（NPS）、256～258aa（NQT）和286～288aa（NAI）［4］。糖基化作为一种主要的翻译后修饰对蛋白质功能有着重要影响，病毒蛋白的糖基化在病毒的生命周期中起着重要的作用。目前有PCV2Cap蛋白N－糖基化位点突变对PCV2核酸疫苗免疫原性影响的报道［5］，但Rep蛋白N－糖基化位点突变在病毒复制及致病性中的作用如何未见报道。

Fenaux等［6］报道，双拷贝PCV2DNA克隆的感染性明显强于单拷贝PCV2DNA克隆，拯救病毒的增殖滴度接近其亲本病毒。因此，本研究拟在前期实验室构建好的单拷贝PCV2感染性克隆［7］的基础上，获得三个单点突变的双拷贝PCV2全长感染性克隆。在体外拯救突变病毒的基础上，进行接种PK－15细胞，研究突变病毒的复制性，以明确Rep蛋白N－糖基化位点突变对病毒复制的影响，为进一步阐明PCV2的复制及致病机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞和质粒

无猪圆环污染的PK－15细胞、重组质粒PEASY－Blunt－PCV2、单拷贝突变体感染性克隆M 23、M 256、M 286由山东省畜禽疫病防治及繁殖重点实验室制备保存。

1.2 主要试剂

PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；TransStartTM FastPfu DNA聚合酶、Trans－T1感受态细胞、pEASY－Blunt Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司；普通质粒小提试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；T4DNA连接酶、dNTP、DNA Marker DL－2 000和DL－5 000购自宝生物工程（大连）有限公司；限制性核酸内切酶BamHI、SacII、XhoI购自NEB有限公司；LipofectamineTM 3 000、胰酶、DMEM细胞培养基购自英潍捷基（上海）贸易有限公司；PCV2／Cap单克隆抗体由山东省畜禽疫病防治及繁殖重点实验室制备保存；D－氨基葡萄糖、FITC标记的羊抗鼠的二抗均购自美国Sigma－Aldrich公司。

1.3 主要仪器

PTC－2000型PCR仪购自美国MJResearch公司；核酸定量仪购自购自美国Thermo公司；Light－Cycle480购自美国罗氏公司；冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；CO2培养箱购自美国Thermo公司。

1.4 引物设计

根据GenBank上已发表的PCV2基因序列，利用Premier 5.0软件设计、合成1对含有SacII、XhoI酶切位点及1对含有SacII、BamHI酶切位点的能扩增PCV2全长的PCR引物P1、P2、P3、P4。

1.5 双拷贝突变体2M23、2M256、2M286及未突变体2PCV2的构建

1.5.1 A片段的构建 分别以重组质粒PEASYBlunt－PCV2及单拷贝突变体感染性克隆M 23、M 256、M 286为模板，P1、P2为引物扩增其全长。使用50μL体系：引物（10μM各2μLdNTPs10 mM）2μL；TransStartTM FastPfu DNA聚合酶1 μL；5×TranStart FastPfu Buffer 10μL；模板20倍稀释后取2μL；灭菌水补齐50μL。反应程序为：预变性95℃10min，变性95℃1min，退火59℃1min，延伸72℃2min，共35个循环；最后72℃延伸10min。跑胶回收1 767bp的片段并用XhoI、SacII限制性内切酶进行双酶切、胶回收后命名为A片段。

1.5.2 B片段的构建 分别以重组质粒PEASYBlunt－PCV2及单拷贝突变体感染性克隆M 23、M 256、M 286为模板，用引物P3、P4扩增其全长，其他同1.5.1。胶回收1 767bp的片段并用BamHI、SacII限制性内切酶双酶切、胶回收后命名为B片段。

1.5.3 C载体的构建 将重组质粒PEASY－Blunt－PCV2进行XhoI、SacII限制性内切酶双酶切，跑胶回收大小约为3 900bp的片段并命名为C载体。

1.5.4 D载体的构建 将A片段用T4DNA连接酶连入C载体。双酶切验证正确后命名为D载体。1.5.5 双拷贝感染性克隆的构建 用BamHI、SacII限制性内切酶双酶切D载体，跑胶回收大小约为5 700bp的片段，将B片段连入该载体，转化Trans－T1感受态细胞中，并进行双酶切、测序鉴定。

1.6 重组质粒转染及间接免疫荧光检测

将生长到对数期的无PCV污染的PK－15细胞用胰酶进行常规消化铺6孔板，每空2mL，密度为0.25×106～1×106，37℃培养。待细胞铺满70%～90%时按照LipofectamineTM3 000转染试剂盒说明书将2M23、2M256、2M286和2PCV2DNA克隆质粒转染无PCV污染的PK－15细胞，并设立空载体转染为对照。在转染后48h参照文献［8］中的方法，对转染细胞进行洗涤、固定等处理后，用PCV2／Cap单克隆抗体作为一抗，用FITC－羊抗鼠IgG作为二抗，进行间接免疫荧光试验（IFA）来检测病毒抗原；同时将部分拯救病毒接种新培养的PK－15细胞并连续传至5代。

1.7 拯救病毒TCID50的测定

取拯救病毒2M23、2M256、2M286和2PCV2每一代的细胞培养物分别以10－1～10－8的稀释度接种到96孔细胞板，培养72h后进行IFA检测，按照Reed－Muench法计算其TCID50。测定拯救病毒在细胞中的增殖规律。

1.8 荧光定量PCR检测细胞的病毒载量

将盲传至第5代的细胞毒2M23、2M256、2M 286和2PCV2DNA反复冻融后分别提取DNA，用实验室之前建好的以0RF2为靶基因的SYBRGreen实时荧光定量PCR方法进行定量检测［9］，研究细胞中病毒核酸的变化规律。反应体系为25 μL：2×SYBR Premix Ex TaqTM 12.5μL、引物各1μL、模板2μL、去离子水8.5μL。荧光定量PCR反应条件为：95℃5min，95℃20s，55℃20s，70℃30s且收集荧光信号，40个循环。

图1 D载体双酶切鉴定结果Fig.1 Restriction enzyme digestion identification of D vector by enzyme digestion

2 结果与分析

2.1 双拷贝2M23、2M256、2M286和2PCV2感染性克隆的鉴定

将D载体用XhoI、SacII进行双酶切产生2个条带，大小分别与PEASY－Blunt载体片段（3 929 bp）和A片段（1 767bp）相符（图1）。2M23、2M 256、2M286和2PCV2经BamHI、SacII双酶切后得到2个条带，大小分别与D载体（5 700bp）和B片段（1 767bp）相符（图2）。

图2 双拷贝感染性克隆酶切鉴定结果Fig.2 Identification of double copies Infectious clone by enzyme digestion

2.2 测序鉴定结果

将重组质粒2M23、2M256、2M286和2PCV2及盲传5代后的拯救病毒DNA进行测序鉴定。结果显示，双拷贝全基因组按照预先设计的成功顺式串联入载体；盲传5代后的病毒DNA除之前设计的ORF1 23aa、256aa、286aa位点由天冬酰胺（N）突变为天冬氨酸（D）之外，其他均与PCV2SD1全基因组（DQ346683）序列完全相同，没有出现其他任何变异。

2.3 IFA检测结果

将盲传5代的转染重组质粒2M23、2M256、2M 286和2PCV2及空载体在72h以后进行IFA检测。如图3所示，所有拯救病毒都能检测到特异性荧光信号，其中2M286和2PCV2（图3C、D）的荧光强度和荧光数量明显高于2M23和2M256（图3A、B），而转染空载体的PK－15细胞则没有特异性荧光染色。检测结果表明，PCV2Rep蛋白N－糖基化位点突变后病毒均能在PK－15细胞内表达，但N－糖基化位点23～25aa、256～258aa突变后表达量明显低于未突变体病毒；N－糖基化位点286～288aa突变后对表达量影响较小。

图3 拯救病毒IFA的检测结果（200×）Fig.3 Rescued viruses detected by IFA（200×）

2.4 病毒TCID50的测定结果

对上述拯救的病毒以1∶5的比例感染PK－15细胞进行传代培养，表明1～2代的拯救病毒增殖比较缓慢，自第3代起病毒增殖加快，传至第5代病毒

图4 拯救病毒不同代次病毒体外增殖曲线Fig.4 Growth curve of the rescued viruses during different passages

2.5 细胞病毒载量检测结果

用SYBR－Green实时荧光定量PCR方法对突变病毒和亲本病毒进行细胞中病毒载量的定量检测，各突变体病毒与亲本病毒相比差异显著（P＜0.05）。PCV2Rep蛋白的23～25aa、256～258aa N－糖基化位点突变后降低病毒的复制能力册，而286～288aa N－糖基化位点突变后能增强病毒的复制能力（图5）。

3 讨 论

PCV2是引起猪圆环病毒疾病的主要致病因子，是危害目前世界养猪业的重要病原［10］。由于基因型的改变和基因组大小的变化均发生在ORF2内［11］，因此人们的研究热点均集中在PCV2Cap蛋白，而ORF1的研究相对较少。ORF1作为PCV2最大的开放阅读框编码的Rep蛋白对病毒的复制至关重要，PCV1与PCV2相比较，Rep蛋白氨基酸序列同源性达86%，这也是2种血清型PCV病毒产生抗原交叉性的主要原因所在［12］，所以对PCV2Rep蛋白的研究也至关重要。

N－糖基化在病毒的发病机理和免疫逃避中扮演着重要的角色［13］，在病毒颗粒的包装和成熟、感染力及扩散等方面也有着重要的作用［14］。因此，这一领域的研究已成为近年来的研究热点。将PCV2的Cap蛋白N－糖基化位点突变后的PCV2核酸疫苗免疫小鼠能增强DNA疫苗在小鼠体内的特异性反应［5］。为研究Rep蛋白上N－糖基化位点突变后对病毒生理特性的影响，本试验构建了双拷贝单点突变PCV2全长感染性克隆。在体外拯救病毒的基础上，研究N－糖基化位点突变对病毒复制的影响。

图5 细胞中病毒的定量检测Fig.5 Quantitative detection of virus in cells

本研究结果表明，PCV2Rep蛋白的23～25毒价基本稳定。2M232M256突变体病毒毒价明显低于未突变体病毒2PCV2；2M286突变体病毒毒价要稍高于未突变病毒2PCV2的毒价（图4）。aa、256～258aaN－糖基化位点突变后病毒的复制能力明显降低，286～288aaN－糖基化位点突变后反而增强病毒的复制能力。对于N－糖基化两点和三点之间的相互作用，以及对病毒致病力的影响如何需要进一步研究。

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