诺如病毒感染及其实验室检查

林迪，孙长贵

(解放军第117医院检验科南京军区医学检验质控中心，浙江 杭州310013)

诺如病毒(Norovirus，NV)是世界范围内引起人类非细菌性急性胃肠炎的一种高度传染性病原菌[1]，该病毒具有高度感染性,传播途径广泛,人群普遍易感,容易在餐馆、学校、社区、医院、托儿所、养老院等聚集性场所引起集体暴发[2]。在美国，据估计诺如病毒每年将造成2100万人感染，71000人住院治疗，800人死亡[3]。诺如病毒原型株诺瓦克病毒(Norwalk virus)于1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻患者粪便中分离到，1972年Kapikian等人通过免疫电子显微镜从患者的粪便中检测到直径为27 nm的病毒颗粒，命名为诺瓦克病毒[4]。2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒。1995年，中国报道了首例诺如病毒感染，之后山西、北京、安徽、福州、武汉、广州、浙江嘉兴等地区先后发生多起诺如病毒感染性腹泻暴发疫情。本文就诺如病毒相关的结构和生物学特性、发病机制、流行病学、临床表现、诊断与鉴别诊断和实验室检查等作简要综述。

1 诺如病毒的结构和生物学特性

诺如病毒属于人杯状病毒科、诺如病毒属，其病毒颗粒直径约为26～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称；负染色电镜照片显示，NV具有典型的羽状外缘，表面有凹痕的小圆状结构。NV为单股正链 RNA病毒,全长约7642bp，包括3个开放阅读框：ORF1编码包括保守的具有RNA多聚酶在内的非结构蛋白；ORF2编码分子量约为56KDa的衣壳蛋白；ORF3编码一种分子量约为22.5KDa的强碱性微小结构蛋白[5]。目前NV尚未能按血清学进行分类，但根据RNA多聚酶区核苷酸序列的相似性，被分为5个基因组：GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ和GⅤ，其中可感染人类有GⅠ、GⅡ和GⅣ[6]，而 GⅢ、GⅡ、GⅤ分别感染牛、猪和鼠。目前，GⅡ是世界范围内NV流行的主要基因型，优势株为GⅡ-4[7]。NV对热、乙醚和酸稳定，室温pH2.7环境下存活 3h，20%乙醚 4℃处理存活 18h，60℃孵育30min仍有感染性，也耐受普通饮水中3.75～6.25mg/L 的 Cl-浓度(游离氯 0.5~1.0mg/L)，但在处理污水的10mg/L的Cl-浓度中被灭活。

2 发病机制

由于NV不能在体外进行细胞培养，也没有合适的动物模型，因此其发病机制的研究受到阻碍[8]。但目前大部分研究证明人组织血型抗原(histoblood group antigens，HBGAs)为 NV 与胃肠道黏膜上皮细胞结合的受体，宿主的遗传因素被认为是NV感染的重要因素[9]。NV通过人组织血型抗原受体与胃十二指肠上皮细胞结合后，将其遗传物质转移至上皮细胞内，在其中复制产生新的病毒，然后再感染十二指肠和空肠上段，并造成上皮细胞空泡变性和微绒毛变短，肠上皮细胞损伤造成一系列生物大分子的数量和活性发生改变，引起糖类和脂类吸收障碍，导致肠腔渗透压升高，体液进入肠腔，出现呕吐和腹泻。

3 流行病学

NV流行地区极为广泛，分布于各大洲，NV感染疫情全年均可发生，但在寒冷季节呈现高峰，NV感染多以集体暴发流行的形式出现。NV感染浓度低(100个病毒颗粒即可导致发病)、环境稳定性以及缺乏持久的免疫力等原因，导致NV感染性强[10,11]，Cannon等报道，发达国家42%~90%的非细菌性腹泻暴发是由NV引起的[12]。我国自1995年报道了首例NV感染，之后许多地区发生NV感染疫情。2006年2月广西大新县农场72人出现NV感染引起的急性胃肠炎症状；2010年12月广州从化发生水污染引起的NV感染事件，共有429人发病；2013年3月，广州大学城多所高校出现因感染NV，而导致的聚集性腹泻病例，累计确诊200多例；2013年4月，广东省揭阳市揭阳职业技术学院近400名学生感染NV；2014年2月嘉兴市多个学校和幼儿园暴发NV感染，累计报告发病人数共511人；2014年11月广州南洋理工职业学院暴发NV感染，受感染人数达274例。由此可见，我国NV感染主要集中在南方城市，广东、浙江、广西等均是多发省份，且暴发起数和病例数均呈逐年增加趋势。

3.1 传染源和宿主范围 传染源主要为NV胃肠炎患者、隐性感染者及病原携带者。以前人被认为是NV的唯一宿主，但近年来猪、牛、鼠等动物的粪便中也检测到该病毒。同时也有很多关于贝类引起NV暴发的报道，但实际上它们并不是宿主，只是寄生。

3.2 传播途径 粪-口途径是NV感染的主要传播方式，可以通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，也可通过吸入悬浮在空中的由污染物形成的气溶胶等形式传播。

3.3 高危人群 NV传染性强，每个年龄段的人均易感，但以学龄儿童和成年人为主[13]。

4 临床表现和病理特点

临床NV感染潜伏期多在24～48h，最短12h，最长72h。感染者发病突然，主要症状为恶心、呕吐、腹痛、肌痛和非血性腹泻[4]。儿童患者呕吐普遍，成人患者腹泻为多，24h内腹泻4~8次，粪便为稀水便或水样便，无黏液脓血，粪检白细胞阴性,未见RBC。原发感染患者的呕吐症状明显多于继发感染者，有些感染者仅表现出呕吐症状，故在临床常称为“冬季呕吐病”。此外，头痛、轻度发热、寒颤也是常见症状，严重者出现脱水症状。

细胞水平的病变为肠上皮细胞微绒毛变短、隐窝增大和细胞内空泡形成；组织水平的病变表现为固有层单核细胞浸润；没有观察到肠上皮细胞坏死和肠黏膜下炎性细胞浸润。

5 诊断与鉴别诊断

5.1 诊断 主要依据流行季节、地区、发病年龄等流行病学资料、临床表现以及实验室常规检测结果进行诊断。

5.1 .1诊断标准

5.1 .1.1疑似病例 (1)潜伏期 24~48h;(2)50%以上发生呕吐;(3)病程 12~60 h;(4)粪便、血常规检查无特殊发现;(5)排除常见细菌、寄生虫及其他病原感染。

5.1 .1.2确诊病例 疑似病例基础上，在粪便标本或呕吐物中检测出诺如病毒。

5.2 鉴别诊断 诺如病毒性胃肠炎与细菌性、真菌性和原虫性腹泻鉴别；与其他病毒性胃肠炎的鉴别。常见的病毒性胃肠炎中，轮状病毒、腺病毒和星状病毒性胃肠炎主要见于婴幼儿，病程较长，多为1周左右。

6 实验室检测

6.1 电镜检查

6.1 .1直接电镜法 (EM)将粪便标本制成悬液离心，负染病毒颗粒后直接镜下观察，根据病毒粒子的大小、形状等鉴定是否为NV。但该方法灵敏度较低，要求每毫升标本中至少有105~106个病毒颗粒，患者早期病毒大量排出时的检出率只有 10%~20%，不适合大规模流行病学调查。

6.1 .2免疫电镜法 (IEM)将粪便标本制成悬液离心得到的病毒颗粒与标准血清共孵育，再经负染后在镜下观察来检测病毒，可用于患者恢复期血清捕捉同型抗原，该方法检出率比直接电镜法高10~100倍。总的来说，电镜设备昂贵，检出率较低，且受操作者的影响较大，不适合广泛普及。

6.2 免疫法 目前较常用的免疫学方法包括放射免疫法(RIA)、生物素-亲和素免疫法(Biotin-Avidin Immunoassay)、酶联免疫法(ELISA)等。RIA既具有免疫反应的高特异性，又具有放射性测量的高灵敏度,该方法可检测抗体升高水平，但其耗时长且需放射性同位素标记；为了简化方法，美国疾病预防控制中心建立了生物素-亲和素免疫法，其灵敏度与RIA法相当，目前该方法已成为美国疾病预防控制中心检测诺瓦克样病毒(NLV)抗原和抗体的标准实验方法之一；ELISA主要用于检测NV核衣壳抗原，该方法操作简单，价格低廉，可用于NV大规模暴发后的筛查，但对于ELISA技术来说其特异性较强在90.91%~96.37%之间，而灵敏度差异较大在43.81%~97.14%之间[14-16]。

6.3 基因芯片 该方法通过在玻璃芯片上以链霉亲和素包被的磁珠作为标记物，采用生物素标记的核酸为样品，通过链霉亲和素与生物素的亲和作用，进行核酸杂交检测，杂交结果以肉眼或通过普通显微镜观测，该方法灵敏度、特异性与RTPCR基本相近，但检测费用较昂贵。

6.4 病毒核酸检测 逆转录聚合酶链反应 (RTPCR)能更准确、灵敏地检测标本中的NV，尤其是低浓度感染 (即可检测粪便中102~104病毒颗粒/ml)，现已广泛用于NV的检测。利用RT-PCR可以快速扩增患者呕吐物、粪便以及水中NV特异性的基因片段，成为NV诊断的金标准。GⅠ、GⅡ型诺如病毒RT-PCR检测引物序列见表1。RT-PCR反应总体积为 25μl：PrimeScript1Step EnzymeMix,1μl；2×1 Step Buffer,12.5μl；G1SKF/G1SKR(33μmol/L)、C0G2F/G2SKR(33μmol/L)各 0.2μl；RNA，10.7μl；DEPC 水补足体系到 25μl。 扩增条件：94℃ 3min；94℃ 30s，55℃30s，72℃1min，共35个循环；最后 72℃延伸 7min。

表1 RT-PCR检测诺如病毒引物序列[6,17]

7 结束语

在我国，诺如病毒暴发平均每起暴发发病89人，暴发规模及危害性均较大[18]。近期，广东省多处学校已陆续发生由诺如病毒感染引起的聚集性疫情，一时间“诺如”成了“登革热”后广州的又一流行词。虽然属于自限性疾病的诺如病毒性胃肠炎症状轻微，但其发病急、传播速度快、涉及范围广，可导致严重的公共卫生问题。目前尚无针对性的抗病毒药物,以对症或支持治疗为主，一般不需使用抗生素,预后良好。由于诺如病毒只寄生于活的宿主细胞内，无法在体外培养，从而不能通过传统的减毒或灭活病毒方式来制备疫苗，因此迄今尚无诺如病毒疫苗问世。眼下，我国已经到了诺如病毒的高发季节，我们应加强诺如病毒感染疫情的防控工作以及提高实验室检测能力，以减少诺如病毒感染疫情的暴发。

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