通阳活血方含药血清对兔缺血再灌注窦房结细胞凋亡和细胞骨架蛋白Vinculin的影响

刘如秀 彭杰 刘宇

病态窦房结综合征(sick sinus syndrome，SSS)是由于窦房结或其周围组织病变，导致冲动形成和传出障碍而产生的心律失常和一系列临床表现的综合征。通阳活血方是刘志明老中医临证70余年治疗SSS的经验方，临床疗效确切［1］。本实验采用酶标仪、流式细胞分析仪、激光共聚焦显微镜，观察通阳活血方含药血清对模拟缺血再灌注兔窦房结细胞凋亡和骨架蛋白形态结构的影响，探讨其对体外培养窦房结细胞的保护作用。

1 材料与方法

1．1 实验动物

出生24小时内新西兰乳兔，雌雄不拘，由北京隆安实验动物养殖中心提供，批号:11401400000095。

1．2 实验药物

通阳活血方药物组成:附子6 g、红参10 g、当归12 g、黄芪 18 g、三七 3 g，经水煎醇提法制成含1 g/mL生药的无菌中药原液。含药血清制备方法:取成年新西兰大耳白兔40只(由北京隆安实验动物养殖中心提供，批号:11401400000095)，雌雄各半，用随机数字表法随机分为4组，每组10只，通阳活血方含药血清大剂量组按照每日生药量54．96 g/kg·体质量(相当于70 kg成人临床用药量12倍)、中剂量组按照每日生药量27．48 g/kg·体质量(相当于70kg成人临床用药量6倍)、小剂量组按照每日生药量13．74 g/kg·体重(相当于70 kg成人临床用药量3倍)，分别用蒸馏水配置成混悬液给兔灌胃，每天2次，连续7天;空白血清组给予等量正常饮用水。末次给药前禁食不禁水12小时，给药后2小时，耳中央动脉取血，自然分离血清，56℃水浴30分钟灭活处理，0．2μm微孔滤膜过滤除菌，分装为通阳活血方含药血清大、中、小剂量组和空白血清组，－20℃冷存备用。

1．3 试剂

DMEM/F12(1∶1)培养基(美国 Thermo公司产品，批号:NVJ0307);胎牛血清(美国Gibco公司产品，批号:911585);低糖DMEM培养基(美国Hyclone公司产品，批号:DM121501D);胰酶(美晨公司，批号:C1401130);PI-Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(北京大学医学部制剂室);一抗:Monoclonal Anti-Vinculin antibody(美国Sigma公司产品，批号:SAB4200080);二抗:Gote Anti-Mouse IgG(H+L)Rhodamine(TRITC)(美国 Bioworld公司产品，批号:BS11502)。

1．4 主要仪器

酶标仪(550型，美国);流式细胞分析仪(BD，美国);激光共聚焦显微镜(TCS-NT型，德国);防震台(TMC63544，美国)。

1．5 方法

1．5．1 窦房结细胞的分离、培养 新生24小时内的乳兔8只，吸入乙醚麻醉，用75%酒精消毒乳兔皮肤及手术区。沿前正中线剪开胸腔，暴露心脏，将心底部大血管剪断，游离心脏，尽量保留大血管，用PBS充分清洗心脏，解剖镜下分离窦房结区域(上腔静脉与右心房交界处)，用PBS清洗分离的组织，剪碎呈约0．5mm，置于15 mL离心管中，加入0.1%胰酶10 mL，37℃下，消化15分钟，消化完毕，加入5 mL含血清培养基终止消化，用移液枪上下吹打70次，离心400 r/min，5分钟，将上清液移入另一50 mL离心管，将沉淀的组织块再加入0.1%胰酶10 mL，同前法消化，终止消化后，吹打，离心，取上清细胞悬液与第一次的细胞悬液合并，如此重复一次，将三次所得的细胞悬液合并至50 mL离心管，1500 r/min离心10分钟，弃上清，用含血清培养基6 mL重新悬浮细胞。取4个10cm培养皿，各加入10 mL培养基，将细胞悬液等分移入培养基中，置于37℃、CO2浓度5%的细胞培养箱中孵育1小时(差速贴壁)，光镜下观察，可见大量纤维细胞，间质细胞贴壁，将上浮细胞取出置于另4个培养皿中培养，24小时后更换新培养基，之后每48小时更换培养基。

1．5．2 模拟缺血再灌注模型建立及实验分组 以缺氧缺糖模拟缺血，以恢复氧和糖的供应模拟再灌注，用不含胎牛血清的低糖培养基置换原培养基，放入自制的密闭盒中，持续通以N2充分排尽盒内空气，以模拟缺血。放入培养箱中培养16小时后从密闭盒中取出，更换为正常培养基，以模拟再灌注培养3小时。

将细胞分为正常对照组、模型组、空白血清组、含药血清高、中、低剂量组。含药血清高、中、低剂量组及空白血清组分别加入相应兔血清(终浓度10%)，预先培养过夜(约8小时)。造模更换培养基时加入相应含药血清，造模后取窦房结细胞进行实验。

1．5．3 细胞活性检测 将细胞种植于96孔板中，分组，每组取8个复孔，造模后，倒弃培养基，相应检测孔内加入噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)工作液100μL，于培养箱内孵育3小时，取出吸除MTT工作液，加入DMSO100μL，摇匀，待颜色变化，立即上酶标仪检测(设定波长570mm)。

1．5．4 细胞凋亡检测 调整待测细胞浓度为(5×105)～(1×106)个/mL。分组，每组6个样本，造模后，将细胞消化转移至流式离心管内，1500rpm，4℃离心5分钟，弃上清。加入1 mL预冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，同上法离心，弃上清，重复3～4次，加入200ul Binding Buffer，轻轻震荡，使细胞悬浮。加入10μL Annexin V-FITC，轻轻摇匀，避光，室温反应15分钟，加入5ul PI，即上机检测。

1．5．5 细胞骨架蛋白tubulin形态观察14mm盖玻片放入24孔板中进行细胞爬片，细胞贴壁后，选取生长良好的细胞进行实验。分组，造模后吸除培养基，PBS清洗2次，以4%多聚甲醛固定10分钟;吸除多聚甲醛，加入0．02%Triton，37℃培养箱内静置15分钟打孔。PBS清洗3次，加入一抗(1∶500PBS溶液)，放入湿盒内，4℃冰箱孵育过夜;PBS清洗2次，加入二抗(1∶200PBS溶液)常温孵育1小时，甘油封片后上机检测，每组取4个视野，图像采用Image-Pro Plus 6．0进行平均荧光强度分析。

1．6 统计学方法

采用统计程序包SPSS13．0软件对数据资料进行统计分析，计量资料均用均数±标准差±s)表示，各组数据均服从正态分布，方差齐，多组间资料比较采用完全随机方差分析，两两比较采用LSD检验，以P＜0．05为差异显著，以 P＜0．01为差异极显著。

2 结果

2．1通阳活血方含药血清对窦房结细胞活性的影响

MTT比色检测结果显示，模型组活细胞量明显低于空白对照组(P＜0．01)，证明造模方法可行。空白血清组与模型组比较无统计学意义(P＞0．05)，表明兔血清对实验无明显干扰，含药血清高、中、低剂量组活细胞量明显高于模型组(P＜0．05)，显示通阳活血方含药血清能保护窦房结细胞活性，见表1。

2．2 通阳活血方含药血清对窦房结细胞凋亡的影响

流式细胞分析仪检测结果如图1显示，模型组细胞凋亡率明显高于正常对照组(P＜0．01)。空白血清组与模型组无明显差异，含药血清高、中剂量组细胞凋亡率明显低于模型组(P＜0．05)，低剂量组凋亡率与模型组比较无统计学意义，见表1。

2．3 通阳活血方含药血清对窦房结细胞骨架蛋白Vinculin的影响

激光共聚焦显微镜观察结果显示，空白对照组细胞内Vinculin显色明显，数量较多，均匀分布于细胞膜附近(图D);模拟缺血再灌注后的窦房结细胞质内Vinculin数量明显减少(图C)，平均荧光强度明显低于空白对照组(P＜0．01)(表1);含药血清高剂量组Vinculin数量较模型组明显增多，显色明显(图D)，平均荧光强度明显高于模型组(P＜0．01)(表1);中剂量组Vinculin数量较空白组有所减少，但明显优于模型组(图E);空白血清组及低剂量组Vinculin数量较模型组无明显差异(图B、D)。可见通阳活血方含药血清能保护缺血再灌注窦房结细胞Vinculin的形态结构。

表1 各组兔窦房结细胞活性、凋亡率及平均荧光强度

图1 各组流式细胞分析图像

3 讨论

细胞凋亡在心脏传导系统的发育成熟中具有重要的作用，窦房结、房室结与传导阻滞细胞的胚胎发育及出生后数周的发育过程中均有细胞凋亡发生，在窦房结的发育、成熟过程中，凋亡不足可留下引发心率失常的基础，凋亡过度可引起病态窦房结综合征等病变［2］。模拟缺血再灌注可诱导培养窦房结细胞凋亡，且随缺血时间的延长，窦房结细胞凋亡率逐渐增加［3］。鉴于病窦的发病常伴随缺血性心脏病的出现，故窦房结缺血再灌注损伤所致的细胞凋亡可能是其病因之一。

心肌骨架系统破坏是缺血再灌注损伤主要的发生机制［4］，Vinculin是细胞骨架系统中重要成分之一，Vinculin在细胞中与细胞微丝骨架相连，并将微丝锚定于细胞膜上，vinculin也介导细胞外基质与细胞骨架的连接，Vinculin在维持细胞形态、调节细胞粘附、运动、增殖及细胞膜内外信号转导等过程中起重要作用［5］。

图2 各组Vinculin激光共聚焦显微镜图像

通阳活血方是刘志明老中医临证70余年治疗病态窦房结综合征的有效经验方。刘老认为病窦的病机为心肾阳虚、瘀血阻滞，主要证候为阳虚血瘀。心阳不振，心脉失于温煦鼓动，气血运行不利;心阳不能外达，导致阳气郁闭不通，属本虚标实之证，治宜以“通阳活血”为基本法则。通阳活血方由附子、人参、当归等组成。附子辛甘性热，能温心肾之阳;人参大补元气，能助附子之温，振奋心阳，有扶正祛邪之功;当归补血活血，温通经脉，使阳气外达。诸药相配，共奏“通阳活血”之功。

本实验MTT检测结果中，模型组与空白对照组存活细胞量有明显差异，表明造模方法可行;空白血清组与模型组无明显差异，显示兔血清对实验结构无干扰。含药血清高、中、低剂量组存活细胞量都明显高于模型组，且呈浓度依赖的量效关系，表明药物浓度选取有效可行。流式细胞检测结果显示，模型组细胞大量凋亡，证实缺血再灌注是导致窦房结细胞的凋亡的可能原因;含药血清高、中剂量组细胞凋亡率明显低于模型组，显示通阳活血方能减少细胞凋亡是其治疗病窦的可能机制之一。

激光共聚焦显微镜观察显示空白对照组细胞Vinculin显色明显，数量较多，均匀分布于细胞膜附近;模型组Vinculin数量明显减少，表明缺血再灌注使Vinculin大量裂解;Vinculin的破坏能导致胞质中微丝失去锚定点，使骨架网状结构受损，细胞膜失去支持、脆性增加;细胞膜内外信号转导受阻，从而使窦房结细胞在形态结构及功能方面发生病理改变。而含药血清高、中剂量组Vinculin都有不同程度的明显增加。以上实验结果表明通阳活血方保护骨架蛋白Vinculin是其治疗病态窦房结综合征的可能机制之一。

［1］ 刘金凤，汪艳丽，徐利亚，等．益气通阳方治疗病态窦房结综合征临床观察［J］．中国中医药信息杂志，2014，4(21):1-4．

［2］ JamesTN．Apoptosis in congenital heart disease［J］．Coron Artery Dis，1997，8(10):599-616．

［3］ 钟理，宋治远．模拟缺血-再灌注诱导原代培养乳鼠窦房结细胞凋亡的研究［J］．第三军医大学学报，2001，1(23):59-61．

［4］ Iwai K，Hori M，Kitabatake A，et al．Disruption of microtubules as an early sign of irreversible ischemic injury．Immunohistochemical study of in situcanine hearts［J］．Circ Res，1990，67(3):694．

［5］ Ziegler WH ，Gingras AR，Critchley DR，et al．Integrin connections to the cytoskeleton through talin and vinculin［J］．Biochem Soc Trans，2008，36(Pt 2):235-239．