RNAi介导ObR基因沉默对人乳头状甲状腺癌K1细胞增殖与侵袭能力的影响＊

王 帅 孔 霞 张国安 侯 森 崔 文△

（1济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院，山东 济南250062，2山东省医学科学院，济南250022；

3济宁医学院附属济宁市第一人民医院，山东 济宁272011；

4济宁医学院基础学院；5济宁医学院法医学与医学检验学院，济宁272067）

甲状腺癌是目前增长最快的内分泌恶性肿瘤，发生率显著升高。乳头状甲状腺癌占80%～85%，在甲状腺癌中最为常见［1］。有研究显示肥胖人群中甲状腺癌有更高的发病率［2］，是恶性肿瘤发生的危险因素之一。瘦素是由肥胖基因（ob）编码的蛋白类激素。对于食物摄取与能量平衡、新陈代谢、神经内分泌也有调节作用［3］。瘦素受体（ObR）是一种跨膜蛋白，属于Ⅰ类细胞因子超家族［4］，与Leptin瘦素有很高的亲和力。本文探讨敲除ObR基因后对人乳头状甲状腺癌细胞（K1细胞）增殖和侵袭能力的影响。

1 材料和方法

1．1 材料

K1细胞系购于欧洲细胞库。DMEM培养基购自Fisher公司；胎牛血清（FCS）购自杭州四季青公司；ObR基因沉默序列购于上海吉玛制药技术有限公司；LipofectamineTM2000Reagent购于Invitrogen公司；OPTI－MEM 购于 Gibco公司；TRIZOL购于Ambion公司；FastQuant RT Kit（with gDNase）试剂盒购于北京天根生化科技有限公司；SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）试剂盒购于北京天根生化科技有限公司；鼠抗人β－Actin多克隆抗体、羊抗鼠－LgG（H＋L）／HRP、羊抗人多克隆抗体、驴抗羊－LgG（H＋L）／HRP均购于Santa cruz公司。引物由上海生工设计，ObR上 游：5′－ACCTCTGGTTCCCCAAAAAGG－3′，下 游： 5′－TTGGCAAGGCACAAGACAT－3′；GAPDH 上 游： 5′－GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT－3′，下 游：5′－GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG－3′。

siRNA－ObR由上海吉玛基因设计：上游：5′－GUGCAGUGUUCAGAGAUAUTT－3′，下游：5′－AUAUCCCUGAACACUGCACTT－3′；阴性对照上 游：5′－UUCUCCGAACGUGUCACGUTT－3′，下游：5′－AUGUGACACGUUCGGAGAATT－3′。

1．2 方法

1．2．1 K1细胞培养与分组 在37℃5%CO2培养箱内，将K1细胞置于含10%FBS的DMEM培养液中培养，取对数生长期的K1细胞用于实验。实验分为K1－CON组（空白对照组即未转染siRNA－ObR的细胞）、K1－NC组（阴性对照组即转染OPTI－NC－siRNA 的 细 胞 ）和 K1－ObR 组 （转 染OPTI－ObR－siRNA的细胞）。

1．2．2 siRNA构建 实验前一天使用无双抗含血清培养基铺6孔板，细胞密度为6×105／孔。18h，细胞融合度达60%时开始转染。取1．5ml EP管，每管各加入 OPTI－MEM 50μL，分别加入siRNA－ObR各5μL，室温静置5min，制成 A液。另 取 1．5ml EP 管，每 管 各 加 入 OPTI－MEM 50μL，加入 Lipofectamine 2 000 2μL，室温静置5min，制成B液；将B液加入到A液中，轻柔混合，室温静置20min。将A，B混合液加入到每个已经含有OPTI－MEM的6孔板中，前后左右轻轻混匀；培养箱中箱孵育8h后，将转染液换为无双抗含血清培养基。

1．2．3 Real－time PCR检测 1）RNA提取 转染后细胞培养48h，弃去培养基，加入1ml trizol，裂解5min后，轻轻吹打移入1．5ml EP中。加入0．2ml氯仿，剧烈震荡EP管15s，室温孵育3min。4℃12 000g离心15min，将上层吸出至一1．5ml EP管中，加入0．5ml异丙醇，室温孵育10min。4℃12 000g离心4min，吸掉上层液体，加入1ml配置好的75%乙醇。4℃7500g离心5min，吸掉上层液体。加入1ml配置好的75%乙醇，4℃7500g离心5min，吸掉上层液体，空气干燥5min。加 入 适 量 RNAsae－free，轻 轻 混 匀，55℃ 水 浴10min。nano－drop测量模板RNA的浓度和纯度；2）逆转录 冰上解冻，每种溶液漩涡震荡混匀，简短离心收集，所有步骤操作完成快速置于冰上。建立gDNA去除反应体系，置于42℃，孵育3min；建立反转录反应体系，42℃，孵育15min，95℃，孵育3min之后放于冰上，得到cDNA。3）根据试剂盒说明书建立和进行Real－time PCR反应体系。

1．2．4 Western blotting检测 1）总蛋白提取转染后24h提取蛋白，常规消化离心细胞，1．5ml EP管收集；弃去上清，加入1ml预冷的PBS，吹打均匀；1000rpm，离心5min；弃去上清，加入适量RIPA与PMSF（比例为100∶1），轻轻吹打；漩涡震荡30min；4℃，12000rpm，离心30min，吸出上清；测定蛋白浓度，计算出上样体积。2）SDSPAGE电泳 配制10%分离胶，灌胶、水封后，室温凝固40min；配制5%的浓缩胶10ml，插入梳子，室温凝固30min；凝固后将胶板放入电泳槽内，拔掉梳子，电泳槽中加入配制好的电泳液，孔中加入预染蛋白Ladder与已经变性好的蛋白样品；电流最大，恒定电压，电泳4h；PVDF膜、海绵、玻璃棒、吸水纸等浸泡在转膜液中；撬开玻璃板，用转膜液冲洗胶，根据蛋白分子量Mark所示留下样品蛋白对应的条带；放好海绵、滤纸、PVDF膜、胶准备转膜；恒流转膜300A，2h；5%的脱脂奶粉室温封闭1h；一抗4℃孵育过夜；二抗室温孵育1h；ECL试剂盒两种液体等体积混合后对目的蛋白显色，使用ChemiDocMP成像分析仪曝光。

1．2．5 MTT检测 取对数生长期的K1细胞，常规消化，1000rpm，离心5min；弃去上清，加入适量培养基，制成细胞悬液；细胞计数，铺96孔板，细胞密度为5×103／100μL；18h后SiRNA瞬时转染，每组做3个平行复孔；分别在适当时间加入25μL MTT溶液，培养箱中孵育2h加入Lysis Buffer 100μL；过夜后，放于酶标仪上测570nm波长处的OD值。

1．2．6 Transwe ll实验 用30μL 1∶3稀释的Matrigel胶铺于Transwe ll小室上层，2h后加100 μL DMEM培养基水化，上室加入转染好的K1细胞2×105个，下室加入500μL含10%FBS的培养基，每组设3个复孔。放置培养箱中培养72h。72h后取出小室，PBS清洗3遍，棉签轻轻擦去上室内细胞，无水甲醇固定30min，0．5%的结晶紫染色30min，PBS清洗3次，自然风干，每个浓度组正置显微镜下取5个视野拍照。以上实验重复3次，取平均值。

1．3 统计学方法

采用SPSS17．0统计软件进行统计学分析。

2 结果

2．1 RNAi介导ObR基因沉默后K1细胞ObR mRNA的表达

K1细胞转染48h后，提取RNA，做Real－time PCR，检测沉默ObR基因后K1细胞mRNA表达量分 别 是 （0．00218±0．000486）、（0．00357±0．000937）、（0．00426±0．000426），如下图所示与阴性对照组和空白对照组相比siRNA－ObR沉默组的表达量下降了一半。经SPSS统计学分析后F＝7．797、P＝0．021，具有统计学意义（见图1）。说明siRNA－ObR在mRNA水平上能显著抑制K1细胞的基因表达。

图1 沉默ObR基因后K1细胞的mRNA水平的表达量

2．2 RNAi介导ObR基因沉默后K1细胞ObR蛋白的表达

K1细胞转染24h后，提取蛋白做 Western blotting，检测沉默ObR基因后蛋白水平上表达量。以β－actin作为内参，如下图显示ObR基因沉默组比空白对照组与阴性对照组蛋白水平上的表达量下降，相对表达水平分别是（0．455±0．013）、（0．412±0．014）、（0．226±0．0106），经统计学分析F＝287．098、P＝0．000，具有统计学意义（见图2）。

图2 沉默ObR基因后蛋白水平上K1细胞的表达量

2．3 RNAi介导ObR基因沉默对K1细胞增殖的影响

分别在转染24h和48h后，在酶标仪上测吸光度值。24h吸光度值分别是（0．061 8±0．003 5）、（0．057 7±0．004 3）、（0．063 0±0．003 7），（F＝3．243，P＝0．068）；48h吸光度值分别是（0．082 2±0．007 3）、（0．076 5±0．005 6）、（0．081 8±0．00 7）（F＝2．366，P＝0．128）经SPSS分析得出吸光度值没有统计学意义（P＞0．05）（见图3）。沉默ObR基因对K1细胞增殖并没有影响，实验结果得出瘦素及其受体不影响K1细胞的增殖。

图3 沉默ObR基因后对K1细胞活性的影响

2．4 RNAi介导ObR基因沉默对K1细胞侵袭能力的影响

Transwell实验可以检测细胞的侵袭能力，K1细胞转染后铺在上室培养72h后，正置显微镜下拍照选取5个视野计算穿出细胞个数。结果分析数据为（47．00±2．000）、（85．67±0．577）、（92．00±1．00），可见ObR沉默后穿出的细胞个数减少（见图4）。说明靶基因沉默后K1细胞侵袭能力减弱。经统计学分析F＝1001．313、P＝0．000，具有统计学意义。

图4 沉默ObR基因后对K1细胞侵袭的影响

3 讨论

瘦素是一种脂肪因子，在许多恶性肿瘤的发生和发展中起了重要的作用，包括胃癌、乳腺癌、子宫内膜癌和结肠癌等。虽然瘦素在体内的致癌作用并非特别显著，但在大多数癌中起到促进癌细胞增殖的作用［5－10］，抑制癌细胞的凋亡。Uddin［11］等研究了瘦素在甲状腺癌中PI3K／AKT的信号机制，显示瘦素通过PI3K／AKT通路的激活来刺激细胞增殖、抑制细胞凋亡。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，是在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double－stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi技术可以抑制相关癌基因的表达。RNA沉默是在转录水平、逆转录水平和翻译水平上来阻断基因表达，并且可以特异的剔除或关闭特定基因的表达。siRNA通过抑制靶向基因的沉默，阻断下游RNA诱导沉默复合体的生物活性来增强抑制肿瘤的作用。

本实验使用RNAi介导ObR基因沉默分析对K1细胞增殖与侵袭能力的影响。沉默ObR基因后观察对K1细胞增殖的影响，结果显示瘦素对K1细胞的增殖并没有影响。这或许是瘦素及其受体仅仅在患癌的起始阶段起了一定的作用，对与癌细胞生长并没有作用；也或许与瘦素抵抗（瘦素无法发挥应有的效应）有一定的关系，原因还需要通过进一步实验来证明。侵袭性是恶性肿瘤不同于其他疾病的显著特点，若在恶性肿瘤发展的过程中用某些方式阻断这一生物学行为，便可以很好地遏制疾病。本文通过Transwell实验探讨KNAi介导ObR基因沉默对K1细胞侵袭能力的影响。沉默ObR基因后K1细胞的侵袭能力显著下降。siRAN－ObR可以有效沉默K1细胞中ObR基因的表达，降低K1细胞的侵袭能力，因此，si－RAN－ObR可以成为甲状腺癌基因靶向治疗的分子。

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